Поиск

Аннексин V (или Аннексин A5) принадлежит семейству аннексинов, внутриклеточных белков, связывающих фосфолипиды. Аннексин V обычно используется в проточной цитометрии и флуоресцентной микроскопии для определения апоптотических клеток, благодаря его способности специфически связываться с фосфатидилсерином (ФС) кальций-зависимым образом. Метод был впервые описан Koopman с соавт. (1994) [1]. В здоровых клетках ФС содержится только с внутренней стороны плазматической мембраны. Во время апоптоза мембранная асимметрия исчезает, ФС перемещается на наружную сторону мембраны и становится доступным для связывания флуоресцентно меченным Аннексином V. В сочетании с другими прижизненными красителями, такими как йодистый пропидий (PI), метод позволяет различать популяции здоровых (Annexin−PI−), апоптотических (Annexin+PI−) и некротических (Annexin+PI+) клеток [2].Готовый набор содержит все необходимые реагенты для мечения апоптотических клеток с помощью Аннексина V, конъюгированного с AF 647, и PI. AF 647 — яркий флуоресцентный краситель, излучающий в дальнем красном канале, с высоким квантовым выходом флуоресценции и высокой фотостабильностью. Спектр AF 647 сильно отстоит от зелено-желтых длин волн, что делает этот флуорофор незаменимым для мечения клеток, обладающих высокой автофлуоресценцией. Максимум поглощения красителя — 655 нм. Максимум эмиссии — 680 нм. PI — непроницаемый сквозь плазматическую мембрану ДНК-краситель, позволяющий различать популяции некротических, апоптотических и здоровых клеток на основе целостности мембраны. После связывания с ДНК краситель излучает в оранжево-красном канале. Максимум поглощения — 535 нм. Максимум эмиссии — 617 нм.

BDP TR - бордипиррометеновый краситель с длинами волн поглощения и эмиссии, близкими к ROX. BDP TR - яркий, умеренно гидрофобный флуорофор, обладающий небольшой молекулярной массой и длинами волн поглощения и эмиссии, близкими к ROX. Дополнительный линкер на основе аминокапроновой кислоты (C6) увеличивает расстояние между флуорофором и биомолекулой и снижает тушение. Активированные эфиры используются для конъюгации с аминогруппами белков, пептидов и других биомолекул.

Методы количественной оценки пролиферации клеток широко используются при изучении цитотоксичности, в онкологических исследованиях и других областях клеточной биологии. Многие из них позволяют визуализировать пролиферирующие клетки с помощью флуоресцентных красителей и могут быть использованы для проведения скрининга с высокой пропускной способностью. Обнаружение реплицированной во время S-фазы клеточного цикла ДНК является одним из наиболее прямых способов выявления клеточной пролиферации. Обычно для этой цели используют 5-бромо-2’-дезоксиуридин (BrdU) — синтетический аналог тимидина, который включается в дочерние нити ДНК во время ее репликации. Содержащую BrdU ДНК выявляют затем иммунохимически с использованием антител, специфичных к этому нуклеозиду. Быстрой и простой альтернативой иммунохимическому методу является мечение делящихся клеток с помощью другого нуклеозида — 5-этинил-2’-дезоксиуридина (EdU). Как и BrdU, он может быть доставлен в клетку путем его добавления в питательную среду культуры или инъекции животным. EdU также является субстратом клеточных киназ и ДНК-полимераз, благодаря чему он включается в состав ДНК при ее репликации. После этого ДНК дочерних клеток, содержащую этинильные фрагменты, можно пометить с помощью клик-химической реакции с азидами флуоресцентных красителей в присутствии медного катализатора. Меченные таким образом клетки можно детектировать методами микроскопии и цитометрии или использовать для сортировки дочерних клеток и клеток, не претерпевших деления. Lumiprobe предлагает готовый к использованию набор для исследования пролиферации клеток методом клик-химии в пяти вариантах с разными флуоресцентными красителями.

LumiTracker Lyso Green — краситель, свободно проникающий через клеточные мембраны без использования дополнительных детергентов и концентрирующийся в органеллах с низким pH, например, лизосомах. В отличие от 2,4-динитрофенола (DNP), этот краситель не требует использования антител для визуализации органелл. В структуру молекулы LumiTracker Lyso Green входит бордипиррометен (BDP), что придает ей выраженные гидрофобные свойства и обеспечивает хорошую проникающую способность через мембрану клетки. Кроме этого, краситель содержит в своей структуре аминогруппу, которая выступает в роли слабого основания. В нейтральной среде она не полностью протонирована, и молекула красителя остается относительно нейтральной, что способствует лучшему проникновению через клеточную мембрану. Предположительно, попадая в лизосомы с кислой средой, краситель протонируется и таким образом удерживается в составе органеллы с низким pH. Мечение живых клеток проводится с использованием наномолярных концентраций LumiTracker Lyso Green, и окрашивание проходит в течение нескольких минут. LumiTracker Lyso Green может влиять на лизосомальный pH, так что более длительная инкубация может вызвать его повышение, поэтому окрашивание рекомендуется проводить в течение 3-7 минут при 37°C (в зависимости от клеточной линии и протокола окрашивания) перед визуализацией с использованием флуоресцентной микроскопии. LumiTracker Lyso Green имеет максимум поглощения при 504 нм и максимум флуоресценции при 511 нм. Для визуализации лизосом мы также предлагаем LumiTracker Lyso Red для красного канала (максимумы поглощения и флуоресценции при 577 нм и 590 нм, соответственно). LumiTracker Lyso Green поставляется в виде 1 mM раствора в ДМСО.

Активированный N-гидроксисукцинимидный (NHS) эфир красителя HEX (гексахлорфлуоресцеина), чистый 6-изомер. Активированные эфиры обладают реакционной способностью в отношении первичных и вторичных аминогрупп. С их помощью можно метить аминогруппы в белках, пептидах, амино-модифицированных олигонуклеотидах и других целевых молекулах. HEX — производное флуоресцеина, содержащее в своей структуре 6 атомов хлора в качестве заместителей. HEX является аналогом таких красителей, как JOE, BODIPY™ 530/550, VIC™ по спектральным характеристикам с поглощением при 533 нм и эмиссией при 549 нм в желто-зеленой области спектра. HEX NHS-эфир часто используется в секвенировании нуклеиновых кислот, ПЦР/кПЦР и других схожих исследованиях.

CDr20 (Cell Designation red 20) — высокоспецифичный флуорогенный химический зонд для мечения микроглии как в клеточных культурах, так и в мозге живых животных. CDr20 является субстратом специфичной для микроглии UDP-глюкуронозил-трансферазы Ugt1a7c. Глюкуронирование CDr20 с помощью Ugt1a7c вызывает ярко-красную флуоресценцию красителя в микроглии, совпадающую с экспрессией маркеров P2ry12, Csf1r, Cx3cr1 и Iba-1 [1]. CDr20 может быть новым инструментом для идентификации и визуализации микроглии в исследованиях нервных расстройств как in vitro, так и in vivo, а также для сортировки флуоресцентно-активированных клеток микроглии (FACS) после их мечения CDr20.

Во время ферроптоза и митохондриальной стадии апоптоза специфический для митохондрий фосфолипид, кардиолипин, подвергается перекисному окислению. MitoCLox является флуоресцентным зондом, позволяющим отслеживать этот процесс в митохондриях in vivo. MitoCLox состоит из флуорофора BDP 581/591, несущего диенсодержащий мотив (C11), связанного с остатком трифенилфосфония (TPP) через длинный гибкий линкер с двумя амидными связями. MitoCLox похож по структуре на MitoPerOx, но в отличие от него имеет более длинный линкер и содержит две (а не одну, как в MitoPerOx) пептидные связи. Гибкий линкер MitoCLox имитирует пептид SS-20 (Phe-D-Arg-Phe-Lys-NH2), что делает данный индикатор специфичным для кардиолипина. Линкер также увеличивает клеточную проницаемость MitoCLox благодаря дополнительным положительным зарядам на нем. Окисление диена в MitoCLox приводит к значительному увеличению флуоресценции BDP 581/591 при 520 нм и снижению его исходной флуоресценции при 590 нм. Таким образом, окисление MitoCLox может быть измерено либо как снижение поглощения при 588 нм, либо как увеличение эмиссии флуоресценции в ратиометрическом режиме при 520/590 нм [1]. MitoCLox накапливается в митохондриях живых клеток. Максимальное его содержание в клетках достигается через 45-60 мин после добавления индикатора в среду. После удаления MitoCLox из среды флуоресценция клеток медленно снижается и достигает 50% от максимума примерно через 1 ч. Рекомендуемая рабочая концентрация MitoCLox составляет 100-200 нМ [2].

Di-8-ANEPPS представляет собой потенциал-чувствительный краситель семейства амино-нафтил-этенил-пиридиния (Amino-Naphthyl-Ethenyl-Pyridinium, ANEP), который широко используется в качестве быстрореагирующего индикатора мембранного потенциала. Краситель не флуоресцирует в несвязанном с мембранами состоянии и отвечает только на колебания электрического потенциала в окружающей его среде. Скорость оптического ответа Di-8-ANEPPS достаточна для обнаружения миллисекундных колебаний мембранного потенциала в возбудимых клетках, таких как отдельные нейроны и клетки сердца, а также для имиджинга интактного мозга. Величина потенциал-зависимого изменения флуоресценции красителя составляет около 2-10% на 100 мВ. Краситель также демонстрирует потенциал-зависимый сдвиг в спектре возбуждения, что позволяет количественно оценивать колебания мембранного потенциала с использованием ратиометрических подходов. Di-8-ANEPPS обладает более липофильными свойствами и лучше удерживается внешним слое клеточной мембраны, чем другие красители семейства ANEP, что делает его идеально подходящим для долгосрочных экспериментов. Поскольку Di-8-ANEPPS связывается с клеточной мембраной, он может быть также использован в качестве простого маркера плазматических мембран. Максимумы возбуждения/эмиссии Di-8-ANEPPS в метаноле составляют 498/713 нм соответственно. В липидах и клеточных мембранах спектры возбуждения и излучения красителя обычно смещены в синий цвет по сравнению с органическими растворителями. Di-8-ANEPPS можно вводить в клетки прямым добавлением стокового раствора в культуральную среду, с использованием мягкого детергента Pluronic® F-127 или методом ретроградного мечения. В качестве отправной точки используйте рабочую концентрацию 5-10 мкМ. Точную концентрацию красителя следует определять экспериментально.

Аннексин V (или Аннексин A5) принадлежит семейству аннексинов, внутриклеточных белков, связывающих фосфолипиды. Аннексин V обычно используется в проточной цитометрии и флуоресцентной микроскопии для определения апоптотических клеток, благодаря его способности специфически связываться с фосфатидилсерином (ФС), который на ранних стадиях апоптоза перемещается со внутренней стороны клеточной мембраны во внешнюю. Данный аннексин V представлен в форме лиофилизированного конъюгата с AF 488 — ярким, фотостабильным зеленым флуорофором, спектральные характеристики которого сходны с FITC (максимум поглощения — 495 нм, максимум эмиссии — 519 нм). Окрашивание на аннексин V-AF 488 не позволяет разделять популяции апоптотических и некротических клеток. Для этого требуется дополнительное окрашивание клеток непроникающими в живые клетки ядерными красителями — йодистым пропидием или YODi-3. Для этого также можно использовать готовый набор для определения апоптотических клеток с помощью аннексина V-AF 488.

BDP 564/570 — липофильный краситель с эмиссией в оранжевой области. Подходит для мечения различных молекул с первичными и вторичными аминогруппами, в том числе, олигонуклеотидов с амино-модификациями.

Тетраметилродамин (TAMRA) - ксантеновый краситель с эмиссией в оранжевой области. Этот краситель является FRET-акцептором для флуоресцеина (FAM) и иногда используется как тушитель для него. TAMRA, как и другие ксантены, существует в виде двух изомеров (5- и 6-), обладающих очень близкими спектральными свойствами. Этот азид - производное 6-TAMRA. Его можно конъюгировать с терминальными алкинами с помощью медь-катализируемой реакции клик-химии (CuААЦ) , а также с напряженными циклоалкинами (например, циклооктинами) по реакции стерически промотируемого алкин-азидного циклоприсоединения (СПААЦ).

DiI (DiIC18(3); 1,1’-диоктадецил-3,3,3’,3’-тетраметилиндокарбоцианин) — карбоцианиновый краситель, флуоресцирующий в оранжево-красной части спектра. DiI — широко используемый липофильный краситель, который маркирует клеточные мембраны за счет встраивания двух длинных углеводородных цепей (углерод C18) в липидный бислой. Краситель слабо флуоресцирует до включения в мембраны. DiI диффундирует латерально в плазматической мембране, постепенно окрашивая всю клетку, что позволяет использовать его в качестве антероградного и ретроградного трейсера нейронов. В интактной ткани краситель не переходит из меченых клеток в немеченые, однако такой перенос может происходить при разрушении мембран клеток, например, после секционирования образца. DiI часто используется совместно с другими трейсерами в двухцветных окрашиваниях, например, с DiA и DiO.