Биореактивы

Алкинилированный краситель дальней красной/ближней инфракрасной областей спектра для мечения посредством Click Chemistry. Cyanine5.5 - аналог Cy5.5®, известного и широко используемого флуорофора. Этот флуорофор, в числе прочего, применяется для неинвазивного получения изображений из тканей живого организма. Данное алкиновое производное конъюгируется с различными азид-модифицированными биомолекулами в мягких условиях Click Chemistry в присутствии медного катализатора. Реагент растворим в органических растворителях. При этом для эффективной конъюгации можно использовать водные растворы с небольшим содержанием ДМСО. Реагент можно также использовать для мечения небольших молекул красителем Cyanine5.5.

Каталитический буфер для клик-химии (pH 7.0) содержит медь(II), TBTA, ацетат триэтиламмония и ДМСО. Концентрация буфера — 1.5×. Это готовый реагент, подходящий для конъюгирования нуклеиновых кислот и малых молекул. Непосредственно перед реакцией медь(II), входящую в состав буфера, необходимо восстановить до меди(I). В качестве восстановителя рекомендуется использовать аскорбиновую кислоту .

Азидопроизводное флуоресцеина (FAM), чистый 5-изомер. Флуоресцеин до сих пор остается одним из наиболее популярных флуорофоров для мечения биомолекул. Большая часть приборов, предназначенных для детекции флуоресценции, начиная от планшетных сканеров флуоресценции и заканчивая флуоресцентными микроскопами, имеют FAM-канал для детекции флуоресцеина. Флуоресцеин часто используется в измерениях поляризации флуоресценции. Посредством клик-реакции азидопроизводное флуоресцеин можно присоединить к любой молекуле, имеющей алкиновую группу. FAM азид поставляется как в твердом виде, так и в виде раствора в DMSO для использования в нашем рекомендуемом протоколе.

Азид Cyanine5 - реагент для Click Chemistry, поставляющийся в виде 10 мМ раствора в ДМСО и в твердой форме. Этот азид хорошо растворяется в органических растворителях (DMF, DMSO), и поэтому реакции конъюгации в водных растворах следует проводить в присутствии некоторого количества органического растворителя. Этот азид хорошо вступает в конъюгацию в водно-органических смесях. Раствор в ДМСО готов для использования в биоконъюгации в соответствии с нашим рекомендуемым протоколом. Доступна и водорастворимая версия данного реагента - sulfo-Cyanine5 азид. Cyanine5 - аналог Cy5®, один из наиболее широко используемых флуорофоров, совместимый с различными приборами для детекции флуоресценции. По спектральным свойствам он схож с DyLight 649.

Азид-ПЭГ4-карбоновая кислота — бифункциональный линкер, содержащий терминальные карбоксильную и азидо-группы. Данная молекула гидрофильна и подходит для синтеза водорастворимых конъюгатов. Азидная группа может вступать в реакции [3+2]-диполярного циклоприсоединения с биомолекулами, содержащими алкиновый фрагмент, а карбоксильная группа может быть активирована и реагировать с различными аминами, в том числе в составе пептидов и белков. Репертуар полученных биоконъюгатов может быть довольно широким, таким способом можно получать конъюгаты антител с лекарственными средствами (ADC-antibody drug conjugates). При этом введение ПЭГ-линкера может повысить стабильность и растворимость в воде, а также снизить иммуногенность биомолекул.

BDP 650/665 — это яркий флуоресцентный краситель, испускающий свет в дальней красной области, аналогичный по спектральным свойствам BODIPY™ 650/665 и Cy5™. Он обладает высоким квантовым выходом и относительно нечувствителен к полярности растворителя и изменению pH. Благодаря выраженной гидрофобности BDP 650/665 может использоваться для окрашивания мембран, липидов и других липофильных соединений. Введенный в структуру данной молекулы заместитель ДБЦО — это дибензоциклооктин, широко используемый в реакциях безмедной клик-химии. BDP 650/665 ДБЦО может реагировать быстро и без специализированных Cu(I) катализаторов с различными функционализированными азидами, приводя к образованию стабильных конъюгатов красителя с биомолекулами.

Готовые к работе лентивирусные частицы LVT-FusionRed, несущие ген флуоресцентного белка FusionRed, предназначены для трансдукции клеток. Лентивирусный вектор эффективно встраивается в геном клеток-мишеней, вызывая стабильную экспрессию флуоресцентного белка FusionRed через 48-72 часа после добавления к клеточной культуре

Биотин-11-dCTP представляет собой дезоксицитидинтрифосфат (dCTP), связанный с молекулой биотина через 11-ти атомный линкер, обеспечивающий эффективное взаимодействие с авидином или стрептавидином, при этом инкорпорирование в ДНК происходит аналогично природному dCTP. Биотин-11-dCTP служит субстратом для фрагмента Клёнова, T4 и Taq ДНК-полимераз, обратной транскриптазы и терминальной трансферазы. Детекция биотинилированной ДНК возможна с помощью авидина/стрептавидина, конъюгированных с щелочной фосфатазой, либо с использованием соответствующих флуоресцентно-меченных антител. Меченные биотином ДНК/кДНК зонды могут быть использованы для флуоресцентной гибридизации in situ или анализа экспрессии генов на микрочипах.

5-Этинилуридин (EU) — широко используемый в молекулярной биологии реагент для изучения и оценки синтеза РНК. EU свободно проникает в клетки и фосфорилируется киназами в рамках дополнительного пути синтеза пиримидиновых нуклеотидов. Образовавшийся 5-этинилуридин-5’-трифосфат с помощью РНК-полимераз I, II, III встраивается в образующуюся de novo РНК вместо уридина, при этом не встраиваясь в ДНК. Клеточная РНК, содержащая модифицированный уридин, может быть достаточно быстро и с высокой чувствительностью детектирована с использованием клик-реакции и последующей флуоресцентной визуализации. Так, алкинильная группа в пятом положении уридина в структуре образовавшейся РНК реагирует с азидами флуоресцентных красителей или биотина по реакции медь-катализируемого циклоприсоединения (CuAAC). Меченая РНК может быть детектирована различными методами, например с использованием флуоресцентной микроскопии или проточной цитометрии, что позволяет оценить уровни транскрипции в клетке. Кроме этого, в экспериментах in vivo 5-этинилуридин имеет преимущество перед своим аналогом, 5-бромоуридином, поскольку азиды флуоресцентных красителей обладают гораздо лучшей проникающей способностью в ткани по сравнению с антителами, которые используются для детекции 5-бромоуридина. Это позволяет использовать для анализа крупные образцы тканей и органов и окрашивать их целиком.

Алкин-ПЭГ4-Амин - это бифункциональный олигоэтинильный линкер, содержащий как аминную группу, легко реагирующую с различными электрофильными агентами (NHS-эфиры, эпоксиды), так и алкинильную группу для реакций клик-химии. Это позволяет легко конъюгировать различные биомолекулы. Достаточно протяженный и высоко гидрофильный ПЭГ4 обеспечивает эффективную конъюгацию и возможность выделения продукта в водных условиях.

Азидометил-дезоксиуридин (AmdU) — нуклеозид с азидогруппой. Его структура похожа на структуру тимидина, благодаря чему он эффективно встраивается в растущую цепь ДНК при репликации клеточными ферментами, аналогично этинилдезоксиуридину (EdU). Модификация EdU требует дальнейшей конъюгации с азидами в присутствии медного катализатора. В случае AmdU, однако, можно использовать безмедную реакцию стерически промотируемого алкин-азидного циклоприсоединения (спААЦ) с напряженными циклоалкинами, такими как циклооктины. Таким образом, использование AmdU позволяет детектировать растущую ДНК в мягких физиологических условиях клетки, без использования медного катализатора.

Азидопроизводное красителя Cyanine3 для реакций клик-химии, аналог Cy3® азида. Cy3® - один из наиболее широко используемых флуорофоров, который совместим с различными флуориметрами, флуоресцентными микроскопами и системами имиджинга. Благодаря высокому коэффициенту экстинкции, Cyanine3 также очень хорошо детектируется в гелях невооруженным глазом. Этот краситель - несульфированное производное, требующее добавления органического растворителя (DMF, DMSO, ацетонитрила) для конъюгации в водных растворах. Водорастворимый вариант этого красителя - sulfo-Cyanine3 азид. Этот реагент поставляется как в твердом виде, так и в виде 10 мМ раствора в DMSO, готовом для использования в нашем рекомендованном протоколе. Cyanine3 по своим спектральным свойствам идентичен Cy3® и похож на DyLight 549.