Биореактивы

Сайт узнавания и позиция гидролиза: GGTGA(N)8 GGTGA(N)8↑ CCACT(N)7 CCACT(N)7↓ Источник: Из штамма E.coli, несущего клонированный ген AsuHP I из Actinobacillus suis HP. Определение единицы активности: За единицу активности принимается количество фермента, способное гидролизовать 1 мкг λ-ДНК в 50 мкл реакционной смеси в SE-буфере O при 37°С за 1 час. Субстрат для определения активности: ДНК фага лямбда (dam-) Оптимальный буфер: SE-буфер O Активность фермента в различных буферах в процентах от максимальной: B G O W Y ROSE 10-25 50-75 100 75-100 25-50 100 Условия хранения: 15 mM Tris-HCl (pH 7.5), 250 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, 200 мкг/мл BSA, 7 mM 2-меркаптоэтанол, 50% глицерин; Хранить при -20°С. Лигирование: После гидролиза 5-кратным избытком фермента около 30% фрагментов ДНК сшиваются ДНК-лигазой и могут быть повторно расщеплены Неспецифический гидролиз: Картина специфического гидролиза не изменяется при обработке 1 мкг ДНК 5 ед фермента в течение 16 часов при 37°С. Чувствительность к метилированию: Блокируется dam-метилированием при перекрывании (GmATC): GGTGATCС ферментом поставляется: 10 Х SE-буфер O. Примечание: Фермент также может гидролизовать ДНК в положении 9/8 в зависимости от последовательности между сайтомузнавания и местом расщепления.

4-Азидо-L-фенилаланин (4AZP) представляет собой синтетическое производное фенилаланина, которое содержит азидную группу. Мечение с помощью 4AZP является быстрой, чувствительной и нерадиоактивной альтернативой традиционному методу обнаружения синтеза белка de novo. 4AZP способен включаться случайным образом в синтезирующийся белок вместо фенилаланина во время трансляции. Полученные таким образом меченые азидом полноразмерные белки могут быть обнаружены с помощью катализируемой медью клик-реакции с флуоресцентными или биотинилированными алкинами, либо безмедной клик-реакции с циклоалкинами, и использованы для последующей визуализации или очистки.

Источник: Из штамма E.coli, несущего рекомбинантный ген Описание: Экзонуклеаза III E.coli катализирует ступенчатое удаление мононуклеотидов с 3’-гидроксильного конца каждой из цепей двуцепочечной ДНК (работает в направлении 3’—>5’), если у этой ДНК «тупые» или 5’-выступающие концы. Экзонуклеаза III способна использовать в качестве субстрата и ДНК с 3’-выступающими концами, но только в случае, если длина такого выступающего конца менее 4-х нуклеотидов. Фермент также обладает эндонуклеазной активностью по отношению к апуринизированной ДНК, гидролизует РНК в РНК-ДНК-гибридах и обладает 3′-фосфатазной активностью. Определение единицы активности: За одну единицу активности принимали количество фермента, необходимого для образования 1 нмоля кислоторастворимых продуктов гидролиза за 30 мин при 37°С. Оптимальный буфер: SE-буфер Экзонуклеаза III Условия хранения: 10 mM Tris-HCl (pH 7.5); 50 mM KCl; 0.5 mM EDTA; 1 mM 2-меркаптоэтанол; 50% глицерин. Хранить при -20°С.

TMRE широко используется для окрашивания митохондрий в живых клетках и не подходит для протоколов с фиксацией клеток. Этот липофильный и положительно заряженный краситель проникает через плазматическую мембрану клеток, при этом не взаимодействуя с мембранными белками и не образуя агрегатов. Краситель TMRE селективно накапливается в активных митохондриях благодаря трансмембранному потенциалу, который митохондрии поддерживают в нормальном состоянии. Кроме окрашивания митохондрий для их визуализации, TMRE используется для количественной оценки митохондриального мембранного потенциала с помощью уравнения Нернста. Краситель служит инструментом для изучения изменений функционирования митохондрий и жизнеспособности клеток в ответ на исследуемые агенты. Деполяризация митохондрий вследствие запуска процессов апоптоза, некроза или других факторов характеризуется уменьшением мембранного потенциала и, как следствие, уменьшением накопления красителя и его флуоресценции, по сравнению с интактными клетками, имеющими поляризованные митохондрии. Краситель TMRE применяется в флуоресцентной микроскопии, проточной цитофлуориметрии, экспериментах с использованием планшетных ридеров. Краситель имеет максимум возбуждения при 549 нм — он совместим с голубым (488 нм) и желто-зеленым (561 нм) лазерами. Флуоресценция красителя детектируется в канале фикоэритрина (PE) (максимум при 574 нм).

Тирамидная амплификация (TSA) — самый универсальный и эффективный способ усиления интенсивности флуоресцентного сигнала, применяемый в иммуногистохимии (ИГХ, IHC), иммуноцитохимии (ICC) и флуоресцентной гибридизации in situ (FISH). Метод TSA основан на способности пероксидазы хрена (HRP) в присутствии низких концентраций пероксида водорода превращать меченый тираминсодержащий субстрат в окисленный, высокореактивный свободный радикал, который ковалентно связывается с остатками тирозина белковых молекул, расположенных рядом с ним. По сравнению с обычными процедурами, метод TSA увеличивает чувствительность иммунофлуоресцентного обнаружения целевых молекул более чем в 100 раз, благодаря чему он особенно подходит для обнаружения мишеней с низкой концентрацией. В применениях, где не требуется повышение чувствительности обнаружения, TSA позволяет значительно снижать концентрации антител или зондов без потери интенсивности сигнала, и тем самым уменьшать фоновое окрашивание, возникающее из-за перекрестной реактивности или неспецифического связывания антител. Поскольку связывание тирамидной метки является ковалентным, тирамиды разных красителей можно использовать в нескольких последовательных раундах TSA-окрашивания, для обнаружения нескольких мишеней в одном и том же образце. Данный тирамид — конъюгат водорастворимого зеленого флуоресцентного красителя AF 488. AF 488 тирамид является компонентом многих наборов для тирамидной амплификации сигнала. Этот реагент можно использовать с любым антителом или другими молекулами (стрептавидин и др.), конъюгированными с HRP, для окрашивания клеток и тканей методами иммунофлуоресценции.

DiO, также называемый DiOC18(3), представляет собой зеленый флуоресцентный липофильный карбоцианиновый краситель. Максимум возбуждения DiO составляет 487 нм, а максимум эмиссии — 501 нм. DiO широко используется в качестве антероградного и ретроградного нейротрейсера в живых и фиксированных тканях и клетках. DiO равномерно метит нейроны посредством диффузии в плазматической мембране. В интактной ткани краситель не переходит из меченых клеток в немеченые, однако, такой перенос может наблюдаться при повреждения мембран, например, после секционирования ткани. DiO и DiI часто используются вместе в двухцветных исследованиях. При этом DiO имеет более медленную скорость боковой диффузии в мембранах, чем DiI.

DiI (DiIC18(3); 1,1’-диоктадецил-3,3,3’,3’-тетраметилиндокарбоцианин) — карбоцианиновый краситель, флуоресцирующий в оранжево-красной части спектра. DiI — широко используемый липофильный краситель, который маркирует клеточные мембраны за счет встраивания двух длинных углеводородных цепей (углерод C18) в липидный бислой. Краситель слабо флуоресцирует до включения в мембраны. DiI диффундирует латерально в плазматической мембране, постепенно окрашивая всю клетку, что позволяет использовать его в качестве антероградного и ретроградного трейсера нейронов. В интактной ткани краситель не переходит из меченых клеток в немеченые, однако такой перенос может происходить при разрушении мембран клеток, например, после секционирования образца. DiI часто используется совместно с другими трейсерами в двухцветных окрашиваниях, например, с DiA и DiO.

Биотин-ПЭГ4-азид — соединение для биотинилирования методом клик-химии. Реагент позволяет метить алкинилированные молекулы (такие как ДНК, олигонуклеотиды и белки) биотином с помощью катализируемой медью или безмедной клик-реакций. Биомолекулы, меченные биотином, могут быть затем связаны с авидином или стрептавидином для дальнейшей их очистки или детекции. Данное азидопроизводное содержит длинный гидрофильный ПЭГ4-линкер, который разделяет в пространстве остаток биотина и связанную с ним биомолекулу для более эффективного связывания биотина со стрептавидином. Линкер также увеличивает растворимость вещества в воде, что упрощает его конъюгацию. Данный азид может конъюгироваться со многими молекулами.

Одноразовые колонки, предварительно заполненные Sephadex™ G-25 DNA Grade и водой с консервантом, предназначенные для быстрой (менее чем за 15 мин) и эффективной очистки ДНК методом гель-фильтрации. Колонки можно использовать для любой ДНК длиной более 10 нуклеотидов. Они позволяют производить обессоливание и замену буфера в образце ДНК, а также удалять низкомолекулярные примеси из реакционных смесей после мечения олигонуклеотидов. Являются аналогом колонок NAP™-10. Колонки для очистки ДНК на объем образца 1 мл идеально подходят для очистки олигонуклеотидов или очень коротких фрагментов ДНК после их синтеза или мечения и дальнейшего использования в таких методах, как ПЦР-амплификация и секвенирование. Внимание! Колонки для очистки ДНК не удаляют из раствора и не денатурируют ферменты.

Иммуноглобулины IgM человека (H Imm), могут быть использованы в качестве высокоочищенного антигена для иммунизации, рефернс-стандарта, антигена для покрытия пластиковых поверхностей в ИФА и других иммунологических тестах, лиганда для приготовления иммуносорбентов. По данным SDS-Page электрофореза в препарате H Imm содержится: IgM человека > 95 % IgG, IgA человека 2 % Прочие сывороточные белки человека 2 % Молекула IgM обычно существует в пентамерной форме (молекулярная масса около 900 кДа), изредка - в виде других полимерных комплексов и весьма редко - как мономер. IgM представляют собой классические поверхностные иммуноглобулины, связанные с клеточной мембраной зрелых B-лимфоцитов. Они имеют четыре консервативных домена. Пентамерные молекулы IgM удерживаются с помощью J-цепей. IgM имеет высокое сродство к комплементу.

Описание: Представляет собой плазмидуpBR322, гидролизованную ферментом AluI с образованием 16 фрагментов,пригодных для использования в качестве стандарта молекулярныхвесов в агарозном и полиакриламидном гель-электрофорезе. Длины фрагментов Длина фрагмента, п.н. Длина фрагмента, п.н. Длина фрагмента, п.н. Длина фрагмента, п.н. 908 403 136 49 659 281 100 19 656 257 63 15 521 226 57 11 Условия хранения: 10 mM Tris-HCl (pH 7.8); 1 mM EDTA; 50 mM NaCl.. Хранить при – 20°С. Примечание: Рекомендуется наносить 1 мкг ДНК маркера на 1 дорожку. Перед использованием в ДНК маркер добавить1/10 объема SE-буфера для нанесения с красителем. Маркер с красителем может храниться при 4-8°С в течение 6 месяцев.

Талидомид-содержащий билдинг-блок с PEG2-линкером и азидной группой для конъюгации с алкин-функционализированными линкерами и лигандами целевых белков посредством клик-химических реакций. Комбинированные молекулы выборочного протеолиза белка (PROteolysis TArgeting Chimeras, PROTACs) — это гетеробифункциональные молекулы, способные проникать через клеточную мембрану, и позволяющие удалять выбранный целевой белок из клетки. Один конец молекулы PROTAC содержит лиганд, способный связываться с белком интереса, а второй — с субтрат-распознающим белком белкового комплекса E3-лигазы. Сближение белка и E3-лигазы вызывает полиубиквитинирование субстрата с последующей его деградацией клеточной протеасомой, которая распознает убиквитиновую метку. Существует несколько Е3-лигазных комплексов, которые на практике подходят для PROTAC. Талидомид — лиганд, который позволяет мобилизовать цереблон E3-лигазу (CRBN). Его используют многие новые исследовательские препараты работающие по механизму PROTAC, находящиеся на последних стадиях клинических испытаний.