Pkr I

MD ДНК эндонуклеаза Aox I. Метилзависимая ДНК эндонуклеаза отличается от эндонуклеаз рестрикции тем, что режет ДНК исключительно при наличии метильных групп в сайте узнавании. При отсутствии метилирования гидролиз отсутствует. Сайт узнавания и позиция гидролиза: RG(5mC)Y ↑RG(5mC)Y RG(5mC)Y ↓RG(5mC)Y Источник: Arthrobacter oxydans 25K Определение единицы активности: За одну единицу активности принимается количество фермента, необходимое для полного гидролиза линейной формы 1 мкг плазмиды pMHaeIII/DriI за 1 час при 60°С в 50 мкл реакционной смеси. При этом происходит исчезновение исходной линейной формы плазмиды pMHaeIII/DriI (см. рисунок ниже, дор. 4). Субстрат для определения активности: Субстрат pMHaeIII/DriI представляет собой ДНК плазмиды pMHaeIII, линеаризованной эндонуклеазой рестрикции DriI. Плазмида pMHaeIII содержит ген ДНК-метилтрансферазы M.HaeIII из Haemophilus aegyptuus, которая модифицирует сайт узнавания 5` GGCC 3` с образованием 5` GG(5mC)C 3`/3` C(5mC)GG 5`. Оптимальный буфер: SE-буфер AoxI Активность фермента в различных буферах в процентах от максимальной: B G O W Y ROSE 75 25 10 25 75 100 Условия хранения: 10 mM Tris-HCl (pH 7.4); 100 mM NaCl; 0.1 mM EDTA; 7 mM 2-меркаптоэтанол; 50% глицерин. Хранить при -20°С. Лигирование: Неспецифический гидролиз: Не наблюдается неспецифического гидролиза при инкубации 1 ед фермента Aox I с 1 мкг ДНК фага лямбда в течение 16 часов при 60°С в 50 мкл реакционной смеси. Чувствительность к метилированию: Фермент расщепляет только метилированную ДНК. Не расщепляет немодифицированную ДНК . С ферментом поставляется: 10 Х SE-буфер AoxI.

MD ДНК эндонуклеаза Pcs I. Метилзависимая ДНК эндонуклеаза отличается от эндонуклеаз рестрикции тем, что режет ДНК исключительно при наличии метильных групп в сайте узнавании. При отсутствии метилирования гидролиз отсутствует. Сайт узнавания и позиция гидролиза: (5mC)GNNNNNNN(5mC)G (5mC)GNNNNN↑NN(5mC)G G(5mC)NNNNNNNG(5mC) G(5mC)NN↓NNNNNG(5mC) Источник: Из штамма E.coli, несущего клонированный ген PcsI I из Paracoccus carotinifaciens 3K. Определение единицы активности: За одну единицу активности принимается количество фермента, необходимое для полного гидролиза 1 мкг ДНК плазмиды pMHpySE49/DriI за 1 час при 37°C в 50 мкл реакционной смеси. При этом происходит исчезновение исходной линейной формы плазмиды pMHpySE49/DriI и образование двух фрагментов ДНК. Субстрат для определения активности: Плазмидная ДНК pMHpySE49, линеаризованная DriI (pMHpySE49/DriI). pMHpySE49 (3536 п.н.) получена путем лигирования вектора pMTL22/FauNDI/SmaI и ПЦР-фрагмента, содержащего ген метилазы M.HpySE526I (образует 5′-A(5mC)GT-3′) и последовательность ДНК 5′-GACGTATAAAACGTT-3′ 3′-CTGCATATTTTGCAA-5′ В результате, данный субстрат имеет оптимальный сайт PcsI: 5′-A(5mC)GNNNNNNN(5mC)GT-3′ 3′-TG(5mC)NNNNNNNG(5mC)A-5′ Оптимальный буфер: SE-буфер PcsI Активность фермента в различных буферах в процентах от максимальной: B G O W Y ROSE 50-75 50-75 0 10-25 50-75 50 Условия хранения: 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 200 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, 7 mM 2-меркаптоэтанол, 100 μg/ml BSA, 50% глицерин. Хранить при -20°С.Лигирование: Неспецифический гидролиз: Неспецифического гидролиза не наблюдается при обработке 1 мкг ДНК фага лямбда 10 ед фермента в течение 16 часов при 37°С. После инкубации 5 ед фермента в течение 3 часов неспецифического гидролиза одно- и двуцепочечного олигонуклеотидов не наблюдается. Чувствительность к метилированию: Фермент расщепляет только С5-метилированную ДНК. Не расщепляет немодифицированную ДНК. Активность фермента зависит от нуклеотидов, фланкирующих сайт узнавания, и количества метилированных цитозинов. С ферментом поставляется: 10 Х SE-буфер PcsI.

MD ДНК эндонуклеаза Mte I. Метилзависимая ДНК эндонуклеаза отличается от эндонуклеаз рестрикции тем, что режет ДНК исключительно при наличии метильных групп в сайте узнавании. При отсутствии метилирования гидролиз отсутствует. Сайт узнавания и позиция гидролиза: G(5mC)G(5mC)NG(5mC)G(5mC) G(5mC)G(5mC)↑NG(5mC)G(5mC) (5mC)G(5mC)GN(5mC)G(5mC)G (5mC)G(5mC)GN↓(5mC)G(5mC)G Источник: Из штамма E.coli, несущего клонированный ген Mte I из Microbacterium testaceum 17B Определение единицы активности: За одну единицу активности принимается количество фермента, необходимое для полного гидролиза 1 мкг ДНК плазмиды pHspAI10/DriI дополнительно метилированной M.Fsp4HI за 1 час при 55°С в 50 мкл реакционной смеси Определение активности MteI В каждом случае проводилась инкубация фермента с 1 мкг ДНК pHspAI10/DriI/metM.Fsp4HI в 50 мкл реакционной смеси (см. Единица активности). После инкубации аликвота реакционной смеси 15 мкл наносилась на гель. Субстрат для определения активности: Субстрат pHspAI10/DriI/metM.Fsp4HI представляет собой ДНК плазмиды pHspAI10, линеаризованной эндонуклеазой рестрикции DriI и метилированной ДНК-метилтрансферазой Fsp4HI. Плазмида pHspAI10 содержит ген ДНК-метилтрасферазы M.HspAI, которая модифицирует сайт узнавания 5`-GCGC-3` с образованием 5`-G(5mC)GC-3`/3`-CG(5mC)G-5`. Кроме того, данная плазмида дополнительно метилирована ДНК-метилтрасферазой М.Fsp4HI, которая модифицирует сайт 5`-GCNGC-3` с образованием 5`-G(5mC)NGC-3`/3`-CGN(5mC)G-5`. В результате в используемом субстрате имеется один канонический сайт узнавания МteI: 5`-G(5mC)G(5mC)NG(5mC)G(5mC)-3`/3`-(5mC)G(5mC)GN(5mC)G(5mC)G-5`. МteI может также расщеплять сайт узнавания, включающий шесть 5-метилцитозинов [1], однако активность фермента в этом случае меньше более чем на порядок. Оптимальный буфер: SE-буфер W Активность фермента в различных буферах в процентах от максимальной: B G O W Y ROSE 25 75 75 100 50 100 Условия хранения: 10 mM Tris-HCl (pH 7.5); 200 mM NaCl; 0.1 mM EDTA; 7 mM 2-меркаптоэтанол; 200мкг/мл BSA, 50% глицерин. Хранить при -20°С. Лигирование: Неспецифический гидролиз: Не наблюдается неспецифического гидролиза при инкубации 40 ед фермента Mte I с 1 мкг ДНК фага лямбда в течение 16 часов при 55°С в 50 мкл реакционной смеси. Чувствительность к метилированию: Фермент расщепляет только С5-метилированную ДНК. С ферментом поставляется: 10 Х SE-буфер W, pHspAI10/DriI дополнительно метилированная M.Fsp4HI .

MD ДНК эндонуклеаза Glu I. Метилзависимая ДНК эндонуклеаза отличается от эндонуклеаз рестрикции тем, что режет ДНК исключительно при наличии метильных групп в сайте узнавании. При отсутствии метилирования гидролиз отсутствует. Сайт узнавания и позиция гидролиза: G(5mC)NG(5mC) G(5mC)↑NG(5mC) (5mC)GN(5mC)G (5mC)GN↓(5mC)G Источник: Glacial ice bacterium GL24 Определение единицы активности: За одну единицу активности принимается количество фермента, необходимое для полного гидролиза единственного сайта 5`-G(5mC)NG(5mC)-3`/3`-(5mC)GN(5mC)G-5` в 1 мкг линейной формы плазмиды pFsp4HI3/DriI за 1 час при 37°С в 50 мкл реакционной смеси. При этом происходит исчезновение исходной линейной формы плазмиды pFsp4HI3/DriI (см. рисунок ниже, дор. 4). Появление дополнительных продуктов гидролиза (см. рисунок ниже, дор. 4-6) является результатом последующего расщепления ДНК по сайтам 5`-GCNGC-3`/3`-CGNCG-5`, имеющим три 5-метилцитозина. Субстрат для определения активности: Субстрат pFsp4HI3/DriI представляет собой ДНК плазмиды pFsp4HI3, линеаризованной эндонуклеазой рестрикции DriI. Плазмида pFsp4HI3 содержит фрагмент геномной ДНК бактериального штамма Flavobacterium sp. 4H, включающий ген ДНК-метилтрансферазы M.Fsp4HI, и один канонический сайт: 5`-G(5mC)NG(5mC)-3`/3`-(5mC)GN(5mC)G-5` [2]. Оптимальный буфер: SE-буфер Y Активность фермента в различных буферах в процентах от максимальной: B G O W Y ROSE 75 75 25 50 100 100 Условия хранения: 10 mM KH2PO4 (pH 7.45); 200 mM NaCl; 0.1 mM EDTA; 7 mM 2-меркаптоэтанол; 200 мкг/мл BSA, 50% глицерин. Хранить при -20°С. Лигирование: Неспецифический гидролиз: Не наблюдается неспецифического гидролиза при инкубации 1 ед фермента Glu I с 1 мкг ДНК фага лямбда в течение 16 часов при 37°С в 50 мкл реакционной смеси. Чувствительность к метилированию: Фермент расщепляет только C5-метилированную ДНК. Не расщепляет немодифицированную ДНК. С ферментом поставляется: 10 Х SE-буфер Y.

MD ДНК эндонуклеаза Kro I. Метилзависимая ДНК эндонуклеаза отличается от эндонуклеаз рестрикции тем, что режет ДНК исключительно при наличии метильных групп в сайте узнавании. При отсутствии метилирования гидролиз отсутствует. Сайт узнавания и позиция гидролиза: GC(5mC)GGC G↑C(5mC)GGC CGG(5mC)CG CGG(5mC)C↓G Источник: Kocurea rosea 307 Определение единицы активности: За одну единицу активности принимается количество фермента, необходимое дляполного гидролиза 1 мкг линейной формы плазмиды pMHpaII1/DriI за 1 час при 37°С в 50 мкл реакционной смеси. Субстрат для определения активности: Субстрат pMHpaII1/DriI представляет собой ДНК плазмиды pMHpaII1, линеаризованной эндонуклеазой рестрикции DriI. Плазмида pMHpaII1 содержит ген ДНК-метилтрасферазы M.HpaII, которая модифицирует сайт узнавания 5`-CCGG-3` с образованием 5`-C(5mC)GG-3`/3`-GG(5mC)C-5`, и три сайта узнавания KroI 5`-GC(5mC)GGC-3`/3`-CGG(5mC)CG-5`. Оптимальный буфер: SE-буфер G Активность фермента в различных буферах в процентах от максимальной: B G O W Y ROSE 50 100 25 50 75 100 Условия хранения: 10 mM Tris-HCl (pH 7.5); 200 mM NaCl; 0.1 mM EDTA; 7 mM 2-меркаптоэтанол; 50% глицерин, 200 мкг/мл BSA. Хранить при -20°С. Лигирование: Неспецифический гидролиз: Не наблюдается неспецифического гидролиза при инкубации 1 ед фермента Kro I с 1 мкг ДНК фага лямбда в течение 16 часов при 37°С в 50 мкл реакционной смеси. Чувствительность к метилированию: Фермент расщепляет только С5-метилированную ДНК. Не расщепляет немодифицированную ДНК и ДНК, метилированную MspI ДНК-метилтрансферазой. С ферментом поставляется: 10 Х SE-буфер G.

MD ДНК эндонуклеаза Mal I. Метилзависимая ДНК эндонуклеаза отличается от эндонуклеаз рестрикции тем, что режет ДНК исключительно при наличии метильных групп в сайте узнавании. При отсутствии метилирования гидролиз отсутствует. Сайт узнавания и позиция гидролиза: G(mA)TC G(mA)↑TC CT(mA)G CT↓(mA)G Источник: Из штамма E.Coli, несущего клонированный ген Mal из Marinococus albus I. Определение единицы активности: За единицу активности принимается количество фермента, необходимое для гидролиза 1 мкг ДНК pBR322 (dam-метилированной) за 1 час при 37°С в 50 мкл реакционной смеси. Субстрат для определения активности: pBR322 ДНК (dam-methylated) Оптимальный буфер: SE-буфер MalI Активность фермента в различных буферах в процентах от максимальной: B G O W Y ROSE 25 25 50 75 50 50 Условия хранения: 10 mM Tris-HCl (pH 7.5); 100 mM NaCl; 0.1 mM EDTA; 7 mM 2-меркаптоэтанол; 100 ug/ml BSA, 50% глицерин. Хранить при -20°С. Лигирование: После гидролиза 5-кратным избытком фермента более 20% фрагментов ДНК сшиваются ДНК-лигазой и могут быть повторно расщеплены. Неспецифический гидролиз: Картина специфического гидролиза не изменяется при обработке 1 мкг ДНК 10 ед фермента в течение 16 часов при 37°С. Чувствительность к метилированию: Фермент расщепляет только метилированную ДНК. С ферментом поставляется: 10 Х SE-буфер MalI.

MD ДНК эндонуклеаза Bls I. Метилзависимая ДНК эндонуклеаза отличается от эндонуклеаз рестрикции тем, что режет ДНК исключительно при наличии метильных групп в сайте узнавании. При отсутствии метилирования гидролиз отсутствует Сайт узнавания и позиция гидролиза: G(5mC)NGC G(5mC)N↑GC (5mC)GN(5mC)G (5mC)G↓N(5mC)G Источник: Bacillus simplex 23 Определение единицы активности: За одну единицу активности принимается количество фермента, необходимое для полного гидролиза, как минимум, одного сайта 5`-G(5mC)NG(5mC)-3`/3`-CGN(5mC)G-5` в 1 мкг линейной формы плазмиды pFsp4HI3/DriI за 1 час при 30°С в 50 мкл реакционной смеси. При этом происходит исчезновение исходной линейной формы плазмиды pFsp4HI3/DriI (см. рисунок ниже, дор. 4). Субстрат для определения активности: Субстрат pFsp4HI3/DriI представляет собой ДНК плазмиды pFsp4HI3, линеаризованной эндонуклеазой рестрикции DriI. Плазмида pFsp4HI3 содержит фрагмент геномной ДНК бактериального штамма Flavobacterium sp. 4H, включающий ген ДНК-метилтрансферазы M.Fsp4HI, и три канонических сайта: 5`-G(5mC)NG(5mC)-3`/3`-CGN(5mC)G-5`[2, 3]. Оптимальный буфер: SE-буфер W Активность фермента в различных буферах в процентах от максимальной: B G O W Y ROSE 10 10 50 100 75 50 Условия хранения: 10 mM Tris-HCl (pH 7.5); 200 mM NaCl; 0.1 mM EDTA; 7 mM 2-меркаптоэтанол;200 μg/ml BSA; 50% глицерин. Хранить при -20°С. Лигирование: Неспецифический гидролиз: Не наблюдается неспецифического гидролиза при инкубации 5 ед фермента Bls I с 1 мкг ДНК фага лямбда в течение 16 часов при 30°С в 50 мкл реакционной смеси. Чувствительность к метилированию: Фермент расщепляет только метилированную ДНК. Не расщепляет немодифицированную ДНК. С ферментом поставляется: 10 Х SE-буфер W.