Gla I

Метилзависимая ДНК эндонуклеаза отличается от эндонуклеаз рестрикции тем, что режет ДНК исключительно при наличии метильных групп в сайте узнавании.
Сайт узнавания и позиция гидролиза:
R(5mC)GY R(5mC)↑GY
YG(5mC)R YG↓(5mC)R
Источник: Из штамма E.coli, несущего клонированный ген Gla I из Glacial ice bacterium Gl29
Определение единицы активности:
За единицу активности принимается количество фермента, необходимое для полного гидролиза 1 мкг плазмиды pHspAI2/GsaI по единственному сайту 5`-G(5mC)G(5mC)-3`/3`-(5mC)G(5mC)G-5` за 1 час при 30°С в 50 мкл реакционной смеси. При этом происходит исчезновение исходной линейной формы плазмиды pHspAI2/GsaI и образование двух основных (3,419 и 699 п.н.) фрагментов ДНК (см. рисунок ниже, дор. 3-5). Появление дополнительных продуктов гидролиза (см. рисунок ниже, дор. 6) является результатом последующего расщепления ДНК по сайтам 5`-GCGC-3`/3`-CGCG-5`, имеющим три и два 5-метилцитозина.
Субстрат для определения активности:
Субстрат pHspAI2/GsaI представляет собой ДНК плазмиды pHspAI2, линеаризованной эндонуклеазой рестрикции GsaI. Плазмида pHspAI2 содержит фрагмент геномной ДНК бактериального штамма Haemophilus species A1, включающий ген ДНК-метилтрансферазы M.HspAI, и единственный канонический сайт узнавания GlaI 5`-G(5mC)G(5mC)-3`/3`-(5mC)G(5mC)G-5`[2].
Оптимальный буфер: SE-буфер Y
Активность фермента в различных буферах в процентах от максимальной:
B G O W Y ROSE
75 75 25 25 100 100
Условия хранения: 10 mM Tris-HCl (pH 7.6); 250 mM NaCl; 0.1 mM EDTA; 7 mM 2-меркаптоэтанол; 0,1% Triton X-100, 50 мкг/мл BSA, 50% глицерин. Хранить при -20°С.
Неспецифический гидролиз: Не наблюдается неспецифического гидролиза при инкубации 100 ед фермента Gla I с 1 мкг ДНК фага лямбда в течение 16 часов при 30°С в 50 мкл реакционной смеси.
Чувствительность к метилированию:
Фермент расщепляет только С5-метилированную ДНК. Не расщепляет ДНК, содержащую N4-метилцитозин [1].
С ферментом поставляется: 10 Х SE-буфер Y, плазмида pHspAI2/GsaI.