Di-4-ANEPPS, индикатор потенциала

LumiTracker Lyso Green — краситель, свободно проникающий через клеточные мембраны без использования дополнительных детергентов и концентрирующийся в органеллах с низким pH, например, лизосомах. В отличие от 2,4-динитрофенола (DNP), этот краситель не требует использования антител для визуализации органелл. В структуру молекулы LumiTracker Lyso Green входит бордипиррометен (BDP), что придает ей выраженные гидрофобные свойства и обеспечивает хорошую проникающую способность через мембрану клетки. Кроме этого, краситель содержит в своей структуре аминогруппу, которая выступает в роли слабого основания. В нейтральной среде она не полностью протонирована, и молекула красителя остается относительно нейтральной, что способствует лучшему проникновению через клеточную мембрану. Предположительно, попадая в лизосомы с кислой средой, краситель протонируется и таким образом удерживается в составе органеллы с низким pH. Мечение живых клеток проводится с использованием наномолярных концентраций LumiTracker Lyso Green, и окрашивание проходит в течение нескольких минут. LumiTracker Lyso Green может влиять на лизосомальный pH, так что более длительная инкубация может вызвать его повышение, поэтому окрашивание рекомендуется проводить в течение 3-7 минут при 37°C (в зависимости от клеточной линии и протокола окрашивания) перед визуализацией с использованием флуоресцентной микроскопии. LumiTracker Lyso Green имеет максимум поглощения при 504 нм и максимум флуоресценции при 511 нм. Для визуализации лизосом мы также предлагаем LumiTracker Lyso Red для красного канала (максимумы поглощения и флуоресценции при 577 нм и 590 нм, соответственно). LumiTracker Lyso Green поставляется в виде 1 mM раствора в ДМСО.

Методы количественной оценки пролиферации клеток широко используются при изучении цитотоксичности, в онкологических исследованиях и других областях клеточной биологии. Многие из них позволяют визуализировать пролиферирующие клетки с помощью флуоресцентных красителей и могут быть использованы для проведения скрининга с высокой пропускной способностью. Обнаружение реплицированной во время S-фазы клеточного цикла ДНК является одним из наиболее прямых способов выявления клеточной пролиферации. Обычно для этой цели используют 5-бромо-2’-дезоксиуридин (BrdU) — синтетический аналог тимидина, который включается в дочерние нити ДНК во время ее репликации. Содержащую BrdU ДНК выявляют затем иммунохимически с использованием антител, специфичных к этому нуклеозиду. Быстрой и простой альтернативой иммунохимическому методу является мечение делящихся клеток с помощью другого нуклеозида — 5-этинил-2’-дезоксиуридина (EdU). Как и BrdU, он может быть доставлен в клетку путем его добавления в питательную среду культуры или инъекции животным. EdU также является субстратом клеточных киназ и ДНК-полимераз, благодаря чему он включается в состав ДНК при ее репликации. После этого ДНК дочерних клеток, содержащую этинильные фрагменты, можно пометить с помощью клик-химической реакции с азидами флуоресцентных красителей в присутствии медного катализатора. Меченные таким образом клетки можно детектировать методами микроскопии и цитометрии или использовать для сортировки дочерних клеток и клеток, не претерпевших деления. Lumiprobe предлагает готовый к использованию набор для исследования пролиферации клеток методом клик-химии в пяти вариантах с разными флуоресцентными красителями.

Активированный эфир красителя AF 555 — яркого, фотостабильного и гидрофильного флуорофора для желтого канала. Активированные эфиры обладают реакционной способностью в отношении первичных и вторичных аминогрупп. С их помощью можно метить аминогруппы в белках, пептидах, амино-модифицированных олигонуклеотидах и других целевых молекулах. AF 555 — гидрофильный флуорофор с высокими квантовым выходом флуоресценции и фотостабильностью, альтернатива тетраметилродамину (TAMRA, TMR) и Cyanine3. Он предназначен для различных применений, включая цитометрию и микроскопию.

Церамиды являются предшественниками сфинголипидов, состоящими из сфингозина и жирной кислоты, соединенных между собой амидной связью. BDP FL церамид представляет собой синтетический флуоресцентный липид, конъюгат зеленого флуоресцентного красителя BDP FL со сфингозином. Внутри клетки BDP FL церамид включается в мембраны аппарата Гольджи, поэтому данный краситель широко используется в клеточной биологии для визуализации аппарата Гольджи в живых и фиксированных клетках методами флуоресцентной микроскопии.

BDP 630/650 - это яркий и фотостабильный дальне-красный флуорофор с высокими молярным коэффициентом экстинкции и квантовым выходом. Он обладает относительно долгим времем жизни возбужденного состояния, и благодаря этому этот краситель полезен для анализа поляризации флуоресценции. Данное производное представляет собой этиловый эфир BDP 630/650 и может применяться для окрашивания липидов и других липофильных соединений.

Singlet Oxygen Sensor Green (SOSG) — флуорогенный индикатор для обнаружения синглетного кислорода (1O2) в водных растворах. SOSG способен встраиваться в живые клетки млекопитающих и может быть использован для визуализации in vivo внутриклеточного 1O2, а также различных клинических исследованиях. Молекула SOSG состоит из двух частей: флуорофора и захватывающего фрагмента — антрацена. В отсутствие синглетного кислорода эмиссия флуорофора гасится за счет переноса электронов с захватывающего фрагмента. SOSG демонстрирует слабую синюю флуоресценцию с максимумами возбуждения/эмиссии при 372/395 и 393/416 нм. В среде, содержащей 1O2, захватывающий фрагмент реагирует с синглетным кислородом и образует эндопероксид антрацена, который после этого перестаёт быть эффективным внутримолекулярным донором электронов. Прекращение тушения приводит к флуоресценции флуорофора с максимумами возбуждения/эмиссии около 504/525 нм.В отличие от других реагентов для детекции 1O2, SOSG обладает высокой селективностью в отношении синглетного кислорода и не проявляет заметной реакции на супероксид (•O2−) или гидроксильный радикал (•OH). Однако он активируется при щелочном pH и в некоторых растворителях, таких как ацетонитрил, ДМСО, ДМФА и ацетон. После получения реагента храните его в сухом и защищенном от света месте при температуре −20°C, не открывая пробирки до начала использования. Для приготовления стокового 5 мМ раствора, растворите содержимое пробирки с 100 мкг вещества в 33 мкл абсолютного метанола. Рабочие растворы SOSG готовят непосредственно перед использованием, излишки разбавленного реагента необходимо утилизировать по окончании работы. Оптимальную рабочую концентрацию SOSG определяют опытным путем, рекомендуемый диапазон начальной концентрации реагента составляет 1–10 мкМ.

Окрашивание по Нисслю — широко используемый гистологический метод визуализации морфологии нервной ткани. Метод основан на взаимодействии основных красителей с нуклеиновыми кислотами клеток. Из-за интенсивного синтеза белка, перикарион нейронов имеет высокое содержание рибосомальной РНК в шероховатом эндоплазматическом ретикулуме (т.н. «вещество Ниссля»), и в следствие этого, окрашивание нейронов основными красителями в цитоплазме более выражено, чем в ядрах. На этом основании окрашенные по Нисслю нейроны можно отличить от глиальных клеток, а данный метод считается специфичным для обнаружения нейронов. Deep-Red Fluorescent Nissl Stain — непроникающий в живые клетки краситель, который не флуоресцирует в отсутствие нуклеиновых кислот. Краситель многократно усиливает свою флуоресценцию при связывании с РНК и ДНК. Длинноволновая флуоресценция Deep-Red Fluorescent Nissl Stain сильно отстоит от зеленого и красного каналов, что делает этот краситель идеальным для экспериментов с многоцветным флуоресцентным мечением.

LUCS 13 — проникающий в клетки ядерный краситель, имеющий яркую зеленую флуоресценцию при связывании с нуклеиновыми кислотами. LUCS 13 является полным структурным аналогом SYTO®13. LUCS 13 используют для окрашивания РНК и ДНК как в живых, так и в мертвых эукариотических клетках, а также грамположительных и грамотрицательных бактерий. Краситель возбуждается при 488 нм, эмиссия регистрируется во флуоресцеиновом канале с пиком 509 нм после связывания с ДНК и 514 нм после связывания с РНК. Краситель может использоваться совместно с непроникающими в живые клетки ядерными маркерами, такими как YoDi-3, для оценки клеточной выживаемости методами флуоресцентной микроскопии и проточной цитометрии.

Hoechst 34580 (бисбензимид, HOE 34580) — проникающий в клетки синий флуоресцентный краситель, прочно связывающийся с богатыми аденином и тимином областями малой бороздки двухцепочечной ДНК. Хотя Hoechst 34580 может связываться со всеми нуклеиновыми кислотами, именно связывание его с нитями дцДНК, богатыми А и Т, значительно усиливает флуоресценцию красителя. Комплекс Hoechst 34580 с ДНК, имеет максимумы возбуждения/эмиссии при 380/438 нм соответственно. Интенсивность флуоресценции Hoechst 34580 увеличивается с увеличением pH растворителя. Несвязанный краситель флуоресцирует в диапазоне 510–540 нм. Зеленая флуоресценция несвязанного Hoechst 34580 может наблюдаться при использовании избыточной концентрации красителя или недостаточном отмывании образца. Hoechst 34580 имеет значительный стоксов сдвиг между спектрами возбуждения и излучения, что делает его идеальным для экспериментов с многоцветным мечением. Hoechst 34580 способен проникать в живые клетки, однако его клеточная проницаемость меньше, чем Hoechst 33342. Как и все красители его семейства, Hoechst 34580 менее токсичен, чем DAPI, что обеспечивает более высокую жизнеспособность окрашенных клеток. Hoechst 34580 широко используется во флуоресцентной микроскопии и проточной цитометрии для окрашивания хромосом и ядер в живых и фиксированных клетках. Краситель часто используется для различения конденсированных пикнотических ядер в апоптотических клетках и сортировки клеток. Флуоресценция Hoechst 34580 гасится бромдезоксиуридином (BrdU), обычно используемым для обнаружения делящихся клеток. Предполагается, что, когда BrdU интегрируется в ДНК, бром деформирует малую бороздку, не позволяя красителям Hoechst достичь оптимального места связывания. Это свойство Hoechst 34580 используется в исследованиях клеточного цикла. Обычно используемая концентрация красителя для окрашивания бактерий или клеток эукариот составляет 0,1–10 мкг/мл.

SynaptoProbe Green является аналогом FM®1-43 — зеленого флуоресцентного красителя, широко используемого для исследования синаптической активности в синапсах и нервно-мышечных соединениях путем окрашивания синаптических пузырьков. SynaptoProbe Green — водорастворимый и нетоксичный для клеток краситель, который не флуоресцирует в водной среде, но обладает сильной флуоресценцией после внедрения во внешний слой клеточной мембраны. Когда нейрон активно высвобождает нейротрансмиттеры, краситель интернализуется в синаптических пузырьках, тем самым окрашивая нервные окончания. SynaptoProbe Green можно использовать для визуализации синаптических пузырьков, их экзоцитоза и эндоцитоза в живых нейронах, выявления активно возбуждающихся нейронов и исследования активность-зависимых механизмов циркулирования везикул. SynaptoProbe Green также может быть использован для визуализации повреждений плазматической мембраны фибробластов.

HMRhoNox-M (также известный как LysoRhoNox) — Fe2+-селективный флуоресцентный индикатор, основанный на контролируемой N-оксидом спироциклизации тетраметил-гидроксиметилродамина. В отсутствие Fe2+ HMRhoNox-M находится в нефлуоресцентной спироциклической форме, демонстрируя лишь незначительную флуоресценцию в водных буферах и при физиологическом значении рН. Добавление Fe2+ вызывает 60-кратное увеличение флуоресценции при 575 нм за счет дезоксигенации диалкиламиногруппы и перехода индикатора в открытую флуоресцентную форму. HMRhoNox-M реагирует на Fe2+ дозозависимым образом. Флуоресцентный ответ HMRhoNox-M высокоизбирателен к Fe2+и не возникает на ионы других переходных металлов, включая Fe3+, а также ионы щелочных и щелочноземельных металлов. HMRhoNox-M — проникающий в клетки и локализующийся в основном в лизосомах индикатор. Он подходит для мониторинга изменений содержания эндогенного лабильного железа в живых клетках, в том числе захвата и транспорта железа трансферрином.

LumiTracker Mito Red FM — катионный красный флуоресцентный краситель, окрашивающий митохондрии в живых клетках. Краситель пассивно диффундирует через плазматическую мембрану и избирательно накапливается в активных митохондриях в зависимости от мембранного потенциала в них, поэтому часто используется для оценки состояния клеток, а также как краситель для локализации митохондрий. Флуоресценция LumiTracker Mito Red FM исчезает после фиксации альдегидами, поэтому данный краситель подходит только для работы с живыми клетками.

DiR — карбоцианиновый краситель, флуоресцирующий в ближней инфракрасной части спектра, для мечения клеточных мембран in vivo и in vitro. DiR диффундирует латерально в плазматической мембране, постепенно окрашивая всю клетку, что позволяет использовать его в качестве антероградного и ретроградного трейсера нейронов. В интактной ткани краситель не переходит из меченых клеток в немеченые, однако такой перенос может происходить при разрушении мембран клеток, например, после секционирования образца. Краситель слабо флуоресцирует до включения в мембраны и в водной среде. DiR может быть использован совместно с другими трейсерами в многоцветных окрашиваниях, например, с DiI и DiO и для NIR-имиджинга.

Di-8-ANEPPS представляет собой потенциал-чувствительный краситель семейства амино-нафтил-этенил-пиридиния (Amino-Naphthyl-Ethenyl-Pyridinium, ANEP), который широко используется в качестве быстрореагирующего индикатора мембранного потенциала. Краситель не флуоресцирует в несвязанном с мембранами состоянии и отвечает только на колебания электрического потенциала в окружающей его среде. Скорость оптического ответа Di-8-ANEPPS достаточна для обнаружения миллисекундных колебаний мембранного потенциала в возбудимых клетках, таких как отдельные нейроны и клетки сердца, а также для имиджинга интактного мозга. Величина потенциал-зависимого изменения флуоресценции красителя составляет около 2-10% на 100 мВ. Краситель также демонстрирует потенциал-зависимый сдвиг в спектре возбуждения, что позволяет количественно оценивать колебания мембранного потенциала с использованием ратиометрических подходов. Di-8-ANEPPS обладает более липофильными свойствами и лучше удерживается внешним слое клеточной мембраны, чем другие красители семейства ANEP, что делает его идеально подходящим для долгосрочных экспериментов. Поскольку Di-8-ANEPPS связывается с клеточной мембраной, он может быть также использован в качестве простого маркера плазматических мембран. Максимумы возбуждения/эмиссии Di-8-ANEPPS в метаноле составляют 498/713 нм соответственно. В липидах и клеточных мембранах спектры возбуждения и излучения красителя обычно смещены в синий цвет по сравнению с органическими растворителями. Di-8-ANEPPS можно вводить в клетки прямым добавлением стокового раствора в культуральную среду, с использованием мягкого детергента Pluronic® F-127 или методом ретроградного мечения. В качестве отправной точки используйте рабочую концентрацию 5-10 мкМ. Точную концентрацию красителя следует определять экспериментально.

FluoriCa-8 AM — проникающий в живые клетки кальциевый индикатор. Краситель метаболизируется внутриклеточными эстеразами, после чего он способен связываться с Ca2+, что приводит к появлению ярко-зеленого флуоресцентного сигнала (λ возбуждения/испускания — 490/514 нм). FluoriCa-8 AM используется для детекции и измерения внутриклеточного Ca2+. Он прекрасно подходит для различных задач флуорометрии и имиджинга, таких как микроскопия, проточная цитометрия, спектрофлуориметрия и флуорометрический высокопроизводительный скрининг на микропланшетах. FluoriCa-8 AM похож по структуре и спектральным свойствам на Ca2+-индикаторы Fluo-3 AM и Fluo-4 AM, но обладает в сравнении с ними самой яркой флуоресценцией (в 2 раза ярче Fluo-4, и в 4 раза ярче Fluo-3). Значение Kd FluoriCa-8 AM для Ca2+ составляет около 389 нМ. Благодаря самой высокой интенсивности флуоресценции, FluoriCa-8 AM прекрасно подходит для задач, когда требуется минимизировать концентрацию загружаемого в клетки красителя. В отличие от Fluo-3 AM и Fluo-4 AM, которые требуют инкубации с клетками при 37°C, FluoriCa-8 AM можно загружать в клетки при комнатной температуре. Поскольку FluoriCa-8 AM не связывается ковалентно с клеточными компонентами, он может активно выводиться из клетки органическими переносчиками анионов, поэтому визуализация клеток in vivo с помощью FluoriCa-8 AM обычно выполняется в течение одного или двух часов после добавления красителя. При этом, краситель может быть повторно загружен в клетки, если это необходимо. FluoriCa-8 AM также можно фиксировать in situ с помощью EDC/EDAC для последующих окрашиваний методами иммунофлуоресценции. FluoriCa-8 AM имеет низкую растворимость в воде. Перед добавления к клеткам рекомендуется приготовить стоковый 1 мМ раствор красителя в ДМСО для мечения. Используйте конечную концентрацию 1–5 мкМ и инкубацию при комнатной температуре в течение 15–60 мин в качестве отправной точки вашего протокола.

YODi-3 (гомодимер Оксазолового Красного, также известный как YOYO®-3) — димерный краситель на основе карбоцианина с флуоресценцией в красной области спектра. YODi-3 — непроникающий в живые клетки ядерный краситель, который не флуоресцирует в отсутствие нуклеиновых кислот. Краситель значительно усиливает свою флуоресценцию при связывании с ДНК. YODi-3 идеален для окрашивания нуклеиновых кислот на микрочипах, а также для контрастного окрашивания ядер и хромосом в экспериментах с многоцветным флуоресцентным мечением благодаря яркому сигналу и низкой фоновой флуоресценции. Одновременное мечение с помощью YODi-3 (непроникающим в клетки) и LUCS 13 (проникающим в клетки прижизненным ядерным маркером) или аннексином V-AF488 можно использовать для оценки жизнеспособности клеток и апоптоза.