H2DCFDA (2′,7′-Дихлородигидрофлуоресцеин диацетат)

Hoechst 33342 (бисбензимид, HOE 33342) — проникающий в клетки синий флуоресцентный краситель, прочно связывающийся с богатыми аденином и тимином областями малой бороздки двухцепочечной ДНК. Хотя Hoechst 33342 может связываться со всеми нуклеиновыми кислотами, именно связывание его с нитями дцДНК, богатыми А и Т, значительно усиливает флуоресценцию красителя. Комплекс Hoechst 33342 с ДНК, имеет максимумы возбуждения/эмиссии при 351/461 нм соответственно. Интенсивность флуоресценции Hoechst 33342 увеличивается с увеличением pH растворителя. Несвязанный краситель флуоресцирует в диапазоне 510–540 нм. Зеленая флуоресценция несвязанного Hoechst 33342 может наблюдаться при использовании избыточной концентрации красителя или недостаточном отмывании образца. Hoechst 33342 имеет значительный стоксов сдвиг между спектрами возбуждения и излучения, что делает его идеальным для экспериментов с многоцветным мечением. Дополнительная этильная группа в Hoechst 33342 делает его более проникающим для клеток, чем DAPI и другие красители семейства Hoechst. Hoechst 33342 обладает в 10 раз большей клеточной проницаемостью, чем Hoechst 33258. Hoechst 33342 также менее токсичен, чем DAPI, что обеспечивает более высокую жизнеспособность окрашенных клеток. Hoechst 33342 широко используется во флуоресцентной микроскопии и проточной цитометрии для окрашивания хромосом и ядер в живых и фиксированных клетках. Краситель часто используется для различения конденсированных пикнотических ядер в апоптотических клетках и сортировки клеток. Флуоресценция Hoechst 33342 гасится бромдезоксиуридином (BrdU), обычно используемым для обнаружения делящихся клеток. Предполагается, что, когда BrdU интегрируется в ДНК, бром деформирует малую бороздку, не позволяя красителям Hoechst достичь оптимального места связывания. Это свойство Hoechst 33342 используется в исследованиях клеточного цикла. Обычно используемая концентрация красителя для окрашивания бактерий или клеток эукариот составляет 0,1–10 мкг/мл. Мы предлагаем Hoechst 33342 в виде сухого вещества (1H010), концентрированного 10 мг/мл водного раствора (2G010), а также в готовой к использованию форме (скоро в продаже).

BDP 505/515 - бордипиррометеновый флуорофор для визуализации липидных мембран. Он характеризуется очень высокой яркостью, а также стабильностью в условиях облучения светом возбуждения в конфокальной микроскопии.

Антитела козы к иммуноглобулинам кролика: ФИТЦ идеально подходят для использования в методах иммунохимии. В ИФА имеют следующую специфичность: Иммуноглобулины кролика 100 % Иммуноглобулины человека <5 %.

Флуоресцентно меченый азид, реагирующий с алкинильными производными биомолекул (терминальными алкинами и циклооктинами) посредством клик-реакций с образованием устойчивых аддуктов. AF 647 — яркий, фотостабильный и гидрофильный флуорофор, излучающий в дальнем красном канале (максимум поглощения — 650 нм, максимум излучения — 671 нм). Азид AF 647 применяется для мечения клеток и их детекции с помощью флуоресцентной микроскопии и проточной цитометрии.

Буфер для приготовления рабочих растворов мембранных красителей серии PKH. Буфер не требует предварительного разбавления и полностью готов к применению. Данный буфер для разведения входит в готовые наборы для мечения клеточных мембран красителями PKH26, PKH2 и PKH800. Буфер для разведения PKH поставляется как набор из пяти стерильных контейнеров по 10 мл 1× дилюента в каждом. Рекомендуется хранить в холодильнике и доводить до комнатной температуры непосредственно перед использованием.

TO-TAP-3 (мономер Тиазолового Красного также известный как TO-PRO®-3) — мономерный краситель на основе карбоцианина с флуоресценцией в дальней красной части спектра. TO-TAP-3 — непроникающий в живые клетки ядерный краситель, который не флуоресцирует в отсутствие нуклеиновых кислот. Краситель многократно усиливает свою флуоресценцию при связывании с двуцепочечной ДНК. TO-TAP-3 обладает ярким сигналом и низкой фоновой флуоресценцией. Он используется для окрашивания нуклеиновых кислот на микрочипах, а также для контрастного окрашивания ядер и хромосом в микроскопии. TO-TAP-3 может использоваться для мониторинга жизнеспособности клеток и обнаружения мертвых клеток в культуре. Длинноволновая флуоресценция TO-TAP-3 сильно отстоит от зеленого и красного каналов, что делает этот краситель идеальным для экспериментов с многоцветным флуоресцентным мечением.

SynaptoProbe Green является аналогом FM®1-43 — зеленого флуоресцентного красителя, широко используемого для исследования синаптической активности в синапсах и нервно-мышечных соединениях путем окрашивания синаптических пузырьков. SynaptoProbe Green — водорастворимый и нетоксичный для клеток краситель, который не флуоресцирует в водной среде, но обладает сильной флуоресценцией после внедрения во внешний слой клеточной мембраны. Когда нейрон активно высвобождает нейротрансмиттеры, краситель интернализуется в синаптических пузырьках, тем самым окрашивая нервные окончания. SynaptoProbe Green можно использовать для визуализации синаптических пузырьков, их экзоцитоза и эндоцитоза в живых нейронах, выявления активно возбуждающихся нейронов и исследования активность-зависимых механизмов циркулирования везикул. SynaptoProbe Green также может быть использован для визуализации повреждений плазматической мембраны фибробластов.

Антитела овцы к иммуноглобулинам мыши: ФИТЦ идеально подходит для иммунохимических методов. В ИФА имеют следующую специфичность: Иммуноглобулины мыши 100 % Иммуноглобулины человека <5 %.

Hoechst 34580 (бисбензимид, HOE 34580) — проникающий в клетки синий флуоресцентный краситель, прочно связывающийся с богатыми аденином и тимином областями малой бороздки двухцепочечной ДНК. Хотя Hoechst 34580 может связываться со всеми нуклеиновыми кислотами, именно связывание его с нитями дцДНК, богатыми А и Т, значительно усиливает флуоресценцию красителя. Комплекс Hoechst 34580 с ДНК, имеет максимумы возбуждения/эмиссии при 380/438 нм соответственно. Интенсивность флуоресценции Hoechst 34580 увеличивается с увеличением pH растворителя. Несвязанный краситель флуоресцирует в диапазоне 510–540 нм. Зеленая флуоресценция несвязанного Hoechst 34580 может наблюдаться при использовании избыточной концентрации красителя или недостаточном отмывании образца. Hoechst 34580 имеет значительный стоксов сдвиг между спектрами возбуждения и излучения, что делает его идеальным для экспериментов с многоцветным мечением. Hoechst 34580 способен проникать в живые клетки, однако его клеточная проницаемость меньше, чем Hoechst 33342. Как и все красители его семейства, Hoechst 34580 менее токсичен, чем DAPI, что обеспечивает более высокую жизнеспособность окрашенных клеток. Hoechst 34580 широко используется во флуоресцентной микроскопии и проточной цитометрии для окрашивания хромосом и ядер в живых и фиксированных клетках. Краситель часто используется для различения конденсированных пикнотических ядер в апоптотических клетках и сортировки клеток. Флуоресценция Hoechst 34580 гасится бромдезоксиуридином (BrdU), обычно используемым для обнаружения делящихся клеток. Предполагается, что, когда BrdU интегрируется в ДНК, бром деформирует малую бороздку, не позволяя красителям Hoechst достичь оптимального места связывания. Это свойство Hoechst 34580 используется в исследованиях клеточного цикла. Обычно используемая концентрация красителя для окрашивания бактерий или клеток эукариот составляет 0,1–10 мкг/мл.

5 mM раствор метилового эфира BDP TR в DMSO, контрастного красителя для зеленого флуоресцентного белка (GFP). Краситель способен проникать в клетки и прокрашивать митохондрии и другие органеллы, без окрашивания плазматических мембран. Краситель совместим с фиксацией формальдегидом.

Тирамидная амплификация (TSA) — самый универсальный и эффективный способ усиления интенсивности флуоресцентного сигнала, применяемый в иммуногистохимии (ИГХ, IHC), иммуноцитохимии (ICC) и флуоресцентной гибридизации in situ (FISH). Метод TSA основан на способности пероксидазы хрена (HRP) в присутствии низких концентраций пероксида водорода превращать меченый тираминсодержащий субстрат в окисленный, высокореактивный свободный радикал, который ковалентно связывается с остатками тирозина белковых молекул, расположенных рядом с ним. По сравнению с обычными процедурами, метод TSA увеличивает чувствительность иммунофлуоресцентного обнаружения целевых молекул более чем в 100 раз, благодаря чему он особенно подходит для обнаружения мишеней с низкой концентрацией. В применениях, где не требуется повышение чувствительности обнаружения, TSA позволяет значительно снижать концентрации антител или зондов без потери интенсивности сигнала, и тем самым уменьшать фоновое окрашивание, возникающее из-за перекрестной реактивности или неспецифического связывания антител. Поскольку связывание тирамидной метки является ковалентным, тирамиды разных красителей можно использовать в нескольких последовательных раундах TSA-окрашивания, для обнаружения нескольких мишеней в одном и том же образце. Данный тирамид — конъюгат водорастворимого дальне-красного флуоресцентного красителя sulfo-Cyanine5.5. sulfo-Cyanine5.5 тирамид (также известный как Cy5.5® и Cyanine5.5 тирамид у других производителей) является компонентом многих наборов для тирамидной амплификации сигнала. Этот реагент можно использовать с любым антителом или другими молекулами (стрептавидин и др.), конъюгированными с HRP, для окрашивания клеток и тканей методами иммунофлуоресценции.

Di-8-ANEPPS представляет собой потенциал-чувствительный краситель семейства амино-нафтил-этенил-пиридиния (Amino-Naphthyl-Ethenyl-Pyridinium, ANEP), который широко используется в качестве быстрореагирующего индикатора мембранного потенциала. Краситель не флуоресцирует в несвязанном с мембранами состоянии и отвечает только на колебания электрического потенциала в окружающей его среде. Скорость оптического ответа Di-8-ANEPPS достаточна для обнаружения миллисекундных колебаний мембранного потенциала в возбудимых клетках, таких как отдельные нейроны и клетки сердца, а также для имиджинга интактного мозга. Величина потенциал-зависимого изменения флуоресценции красителя составляет около 2-10% на 100 мВ. Краситель также демонстрирует потенциал-зависимый сдвиг в спектре возбуждения, что позволяет количественно оценивать колебания мембранного потенциала с использованием ратиометрических подходов. Di-8-ANEPPS обладает более липофильными свойствами и лучше удерживается внешним слое клеточной мембраны, чем другие красители семейства ANEP, что делает его идеально подходящим для долгосрочных экспериментов. Поскольку Di-8-ANEPPS связывается с клеточной мембраной, он может быть также использован в качестве простого маркера плазматических мембран. Максимумы возбуждения/эмиссии Di-8-ANEPPS в метаноле составляют 498/713 нм соответственно. В липидах и клеточных мембранах спектры возбуждения и излучения красителя обычно смещены в синий цвет по сравнению с органическими растворителями. Di-8-ANEPPS можно вводить в клетки прямым добавлением стокового раствора в культуральную среду, с использованием мягкого детергента Pluronic® F-127 или методом ретроградного мечения. В качестве отправной точки используйте рабочую концентрацию 5-10 мкМ. Точную концентрацию красителя следует определять экспериментально.

Стрептавидин представляет собой тетрамерный биотин-связывающий белок, выделенный из бактерии Streptomyces avidinii. Стрептавидин способен с высокой аффинностью и селективностью связывать до четырех молекул биотина посредством множественных водородных связей и ван-дер-ваальсовых взаимодействий. Из-за отсутствия углеводных модификаций и близкого к нейтральному pI, стрептавидин демонстрирует меньшее неспецифическое связывание, в сравнении с другим биотин-связывающим белком — авидином. Стрептавидин обладает высокой термостабильностью и устойчивостью к экстремальным значениям pH, денатурирующим агентам и ферментативной деградации, что позволяет использовать его в широком спектре экспериментальных условий. Флуоресцентные конъюгаты стрептавидина обычно используют в качестве реагента второй ступени для специфического обнаружения различных биотин-меченых биомолекул, таких как белки (антитела и др.), нуклеиновые кислоты, липиды в протоколах непрямого иммунофлуоресцентного окрашивания, вестерн-блоттинге, проточной цитометрии, микропланшетном анализе и других методах детекции. Данный стрептавидин представлен в форме лиофилизированного конъюгата с sulfo-Cyanine5 — гидрофильным дальне-красным флуорофором, спектральные характеристики которого сходны с Cy5® (максимум поглощения — 646 нм, максимум эмиссии — 662 нм). Красители с максимумом флуоресценции в дальнем красном диапазоне (более 650 нм) широко используются в различных методах визуализации благодаря низкому уровню фоновой флуоресценции в данной области спектра. Рекомендуемый диапазон концентраций для использования составляет 0,5-10 мкг/мл. Избегайте использования растворов, содержащих биотин (некоторые сыворотки, RPMI 1640 и т. д.) в качестве разбавителей.

HMRhoNox-M (также известный как LysoRhoNox) — Fe2+-селективный флуоресцентный индикатор, основанный на контролируемой N-оксидом спироциклизации тетраметил-гидроксиметилродамина. В отсутствие Fe2+ HMRhoNox-M находится в нефлуоресцентной спироциклической форме, демонстрируя лишь незначительную флуоресценцию в водных буферах и при физиологическом значении рН. Добавление Fe2+ вызывает 60-кратное увеличение флуоресценции при 575 нм за счет дезоксигенации диалкиламиногруппы и перехода индикатора в открытую флуоресцентную форму. HMRhoNox-M реагирует на Fe2+ дозозависимым образом. Флуоресцентный ответ HMRhoNox-M высокоизбирателен к Fe2+и не возникает на ионы других переходных металлов, включая Fe3+, а также ионы щелочных и щелочноземельных металлов. HMRhoNox-M — проникающий в клетки и локализующийся в основном в лизосомах индикатор. Он подходит для мониторинга изменений содержания эндогенного лабильного железа в живых клетках, в том числе захвата и транспорта железа трансферрином.

FluoriCa-8 AM — проникающий в живые клетки кальциевый индикатор. Краситель метаболизируется внутриклеточными эстеразами, после чего он способен связываться с Ca2+, что приводит к появлению ярко-зеленого флуоресцентного сигнала (λ возбуждения/испускания — 490/514 нм). FluoriCa-8 AM используется для детекции и измерения внутриклеточного Ca2+. Он прекрасно подходит для различных задач флуорометрии и имиджинга, таких как микроскопия, проточная цитометрия, спектрофлуориметрия и флуорометрический высокопроизводительный скрининг на микропланшетах. FluoriCa-8 AM похож по структуре и спектральным свойствам на Ca2+-индикаторы Fluo-3 AM и Fluo-4 AM, но обладает в сравнении с ними самой яркой флуоресценцией (в 2 раза ярче Fluo-4, и в 4 раза ярче Fluo-3). Значение Kd FluoriCa-8 AM для Ca2+ составляет около 389 нМ. Благодаря самой высокой интенсивности флуоресценции, FluoriCa-8 AM прекрасно подходит для задач, когда требуется минимизировать концентрацию загружаемого в клетки красителя. В отличие от Fluo-3 AM и Fluo-4 AM, которые требуют инкубации с клетками при 37°C, FluoriCa-8 AM можно загружать в клетки при комнатной температуре. Поскольку FluoriCa-8 AM не связывается ковалентно с клеточными компонентами, он может активно выводиться из клетки органическими переносчиками анионов, поэтому визуализация клеток in vivo с помощью FluoriCa-8 AM обычно выполняется в течение одного или двух часов после добавления красителя. При этом, краситель может быть повторно загружен в клетки, если это необходимо. FluoriCa-8 AM также можно фиксировать in situ с помощью EDC/EDAC для последующих окрашиваний методами иммунофлуоресценции. FluoriCa-8 AM имеет низкую растворимость в воде. Перед добавления к клеткам рекомендуется приготовить стоковый 1 мМ раствор красителя в ДМСО для мечения. Используйте конечную концентрацию 1–5 мкМ и инкубацию при комнатной температуре в течение 15–60 мин в качестве отправной точки вашего протокола.

DAF-FM диацетат (DAF-FM DA) — проникающий в клетки флуоресцентный индикатор для детекции и количественного определения низких концентраций оксида азота (NO). DAF-FM DA пассивно диффундирует через клеточные мембраны. Попав внутрь клеток, он деацетилируется внутриклеточными эстеразами и превращается в непроникающую сквозь мембраны форму — DAF-FM. Квантовый выход флуоресценции DAF-FM составляет ~ 0,005, однако он увеличивается примерно в 160 раз до ~ 0,81 после реакции с NO с образованием флуоресцентного бензотриазола (максимумы возбуждения / испускания 495/515 нм). DAF-FM более чувствителен для обнаружения NO (предел обнаружения ~3 нМ), чем DAF-2 (~5 нМ). Флуоресценция NO-аддукта DAF-FM не зависит от pH выше pH 5,5. Также NO-аддукт DAF-FM обладает большей фотостабильностью по сравнению с DAF-2 и обеспечивает более надежные результаты и дополнительное время для визуализации. Перед приготовлением рабочего раствора DAF-FM DA следует предварительно растворить в ДМСО. Буферы, содержащие бычий сывороточный альбумин (БСА) или феноловый красный, могут влиять на флуоресценцию, поэтому их следует использовать с осторожностью.

Готовый набор, содержащий все необходимые реагенты для мечения мембран клеток красителем PKH2 с целью последующей оценки клеточной миграции или пролиферации. В наборе используется цианиновый краситель PKH2. В его структуре есть липофильные группы, позволяющие быстро и нековалентно встраиваться в клеточные мембраны практически любых клеток, не влияя на клеточные рецепторы или трансмембранные белки. При этом клетки сохраняют свои биологические свойства и способность к пролиферации, что делает PKH2 отличным флуорофором для изучения как растительных, так и животных клеток in vivo и in vitro. Он также подходит для изучения мембранных везикул. PKH2 испускает свет в зеленой области спектра, с максимумом флуоресценции 504 нм, его можно использовать наряду с другими красителями в многоцветных исследованиях. PKH2 менее стабилен, чем PKH26, и меченные им клетки могут быть исследованы с использованием микроскопии или проточной цитометрии в течение 10-11 дней после окрашивания. Количество измерений, на которое рассчитан набор, может отличаться в зависимости от количества клеток в образце: Набор, содержащий 100 µL красителя PKH2, позволяет проанализировать 25 образцов по 20 миллионов клеток в каждом, при использовании финальной концентрации красителя PKH2 равной 2×10-6 M. Набор, содержащий 500 µL красителя PKH2, позволяет проанализировать 125 образцов по 20 миллионов клеток в каждом, при использовании финальной концентрации красителя PKH2 равной 2×10-6 M. Рекомендуется определить оптимальные количество клеток и концентрацию красителя исходя из типа (ов) клеток и экспериментальных задач.