TO-TAP-3, дальний красный флуоресцентный краситель для нуклеиновых кислот

Hoechst 33342 (бисбензимид, HOE 33342) — проникающий в клетки синий флуоресцентный краситель, прочно связывающийся с богатыми аденином и тимином областями малой бороздки двухцепочечной ДНК. Хотя Hoechst 33342 может связываться со всеми нуклеиновыми кислотами, именно связывание его с нитями дцДНК, богатыми А и Т, значительно усиливает флуоресценцию красителя. Комплекс Hoechst 33342 с ДНК, имеет максимумы возбуждения/эмиссии при 351/461 нм соответственно. Интенсивность флуоресценции Hoechst 33342 увеличивается с увеличением pH растворителя. Несвязанный краситель флуоресцирует в диапазоне 510–540 нм. Зеленая флуоресценция несвязанного Hoechst 33342 может наблюдаться при использовании избыточной концентрации красителя или недостаточном отмывании образца. Hoechst 33342 имеет значительный стоксов сдвиг между спектрами возбуждения и излучения, что делает его идеальным для экспериментов с многоцветным мечением. Дополнительная этильная группа в Hoechst 33342 делает его более проникающим для клеток, чем DAPI и другие красители семейства Hoechst. Hoechst 33342 обладает в 10 раз большей клеточной проницаемостью, чем Hoechst 33258. Hoechst 33342 также менее токсичен, чем DAPI, что обеспечивает более высокую жизнеспособность окрашенных клеток. Hoechst 33342 широко используется во флуоресцентной микроскопии и проточной цитометрии для окрашивания хромосом и ядер в живых и фиксированных клетках. Краситель часто используется для различения конденсированных пикнотических ядер в апоптотических клетках и сортировки клеток. Флуоресценция Hoechst 33342 гасится бромдезоксиуридином (BrdU), обычно используемым для обнаружения делящихся клеток. Предполагается, что, когда BrdU интегрируется в ДНК, бром деформирует малую бороздку, не позволяя красителям Hoechst достичь оптимального места связывания. Это свойство Hoechst 33342 используется в исследованиях клеточного цикла. Обычно используемая концентрация красителя для окрашивания бактерий или клеток эукариот составляет 0,1–10 мкг/мл. Мы предлагаем Hoechst 33342 в виде сухого вещества (1H010), концентрированного 10 мг/мл водного раствора (2G010), а также в готовой к использованию форме (скоро в продаже).

Буфер для приготовления рабочих растворов мембранных красителей серии PKH. Буфер не требует предварительного разбавления и полностью готов к применению. Данный буфер для разведения входит в готовые наборы для мечения клеточных мембран красителями PKH26, PKH2 и PKH800. Буфер для разведения PKH поставляется как набор из пяти стерильных контейнеров по 10 мл 1× дилюента в каждом. Рекомендуется хранить в холодильнике и доводить до комнатной температуры непосредственно перед использованием.

Hoechst 34580 (бисбензимид, HOE 34580) — проникающий в клетки синий флуоресцентный краситель, прочно связывающийся с богатыми аденином и тимином областями малой бороздки двухцепочечной ДНК. Хотя Hoechst 34580 может связываться со всеми нуклеиновыми кислотами, именно связывание его с нитями дцДНК, богатыми А и Т, значительно усиливает флуоресценцию красителя. Комплекс Hoechst 34580 с ДНК, имеет максимумы возбуждения/эмиссии при 380/438 нм соответственно. Интенсивность флуоресценции Hoechst 34580 увеличивается с увеличением pH растворителя. Несвязанный краситель флуоресцирует в диапазоне 510–540 нм. Зеленая флуоресценция несвязанного Hoechst 34580 может наблюдаться при использовании избыточной концентрации красителя или недостаточном отмывании образца. Hoechst 34580 имеет значительный стоксов сдвиг между спектрами возбуждения и излучения, что делает его идеальным для экспериментов с многоцветным мечением. Hoechst 34580 способен проникать в живые клетки, однако его клеточная проницаемость меньше, чем Hoechst 33342. Как и все красители его семейства, Hoechst 34580 менее токсичен, чем DAPI, что обеспечивает более высокую жизнеспособность окрашенных клеток. Hoechst 34580 широко используется во флуоресцентной микроскопии и проточной цитометрии для окрашивания хромосом и ядер в живых и фиксированных клетках. Краситель часто используется для различения конденсированных пикнотических ядер в апоптотических клетках и сортировки клеток. Флуоресценция Hoechst 34580 гасится бромдезоксиуридином (BrdU), обычно используемым для обнаружения делящихся клеток. Предполагается, что, когда BrdU интегрируется в ДНК, бром деформирует малую бороздку, не позволяя красителям Hoechst достичь оптимального места связывания. Это свойство Hoechst 34580 используется в исследованиях клеточного цикла. Обычно используемая концентрация красителя для окрашивания бактерий или клеток эукариот составляет 0,1–10 мкг/мл.

Липофильные карбоцианиновые трейсеры представляют собой цианиновые флуоресцентные красители, несущие длинные гидрофобные углеводородные хвосты. Данные красители обладают низкой флуоресценцией в водной среде, но демонстрируют ее значительное увеличение при включении в липидные бислои. Они эффективно и прочно маркируют цитоплазматические мембраны и внутриклеточные мембранные структуры различных типов клеток [1]. Карбоцианиновые красители используются в исследованиях, изучающих слияние клеток [2], клеточную адгезию [3] и миграцию [4], из-за их минимальной токсичности и отсутствию переносу красителя между клетками. Многоцветное окрашивание разных популяций клеток используют для последующей их идентификации после смешивания клеточных культур. Двойное мечение позволяет точно определить клетки, которые слились друг с другом, либо сформировали кластеры [5]. Кроме того, эти красители широко используются в качестве антероградных и ретроградных аксональных трейсеров в живых [1,6] и фиксированных [7,8] нервных тканях и клетках. Данный набор содержит образцы восьми карбоцианиновых красителей, обладающих различной скоростью мембранной диффузии, растворимостью и флуоресцентными свойствами: DiI (DiIC18(3); 1,1’-диоктадецил-3,3,3’,3’-тетраметилиндокарбоцианин) — яркий и фотостабильный оранжево-красный флуоресцентный липофильный краситель, широко используемый для мечения мембран, трассировки клеток и аксонов, а также для визуализации методом микроскопии сверхвысокого разрешения STORM [9]. DiO (DiOC18(3); 3,3’-диоктадецилоксакарбоцианин) — широко используемый зеленый флуоресцентный липофильный краситель с меньшей скоростью латеральной диффузии в мембранах, чем у DiI. DiO часто используется вместе с DiI для двухцветного мечения. DiA (4-Di-16-ASP; 4-(4-(дигексадециламино)стирил)-N-метилпиридиния йодид) — желто-зеленый флуоресцентный липофильный краситель, который диффундирует гораздо быстрее, чем DiO, в клеточных мембранах. Он часто используется вместе с DiI для двухцветного мечения. DiD (DiIC18(5); 1,1’-диоктадецил-3,3,3’,3’-тетраметилиндодикарбоцианин) — аналог DiI со смещенными в красную область спектрами возбуждения и испускания флуоресценции, что позволяет избегать автофлуоресценции и фототоксических эффектов при визуализации. Краситель широко используется для многоцветного мечения и визуализации методом микроскопии сверхвысокого разрешения STORM [9]. DiR (DiIC18(7); 1,1’-диоктадецил-3,3,3’,3’-тетраметилиндотрикарбоцианин) — флуоресцентный липофильный краситель ближнего инфракрасного диапазона (NIR). Инфракрасная область спектра оптически прозрачна для многих тканей, поэтому DiR можно использовать для визуализации мелких животных in vivo [10] и микроскопии сверхвысокого разрешения STORM [9]. Neuro-DiO — зеленый флуоресцентный липофильный карбоцианиновый краситель. В отличие от DiO, Neuro-DiO обладает лучшей растворимостью в мембранах и менее склонен к образованию нефлуоресцентных агрегатов, снижающих скорость диффузии красителя. RAPID DiI (дилинолеил DiI; FAST DiI™; 1,1’-дилинолеил-3,3,3’,3’-тетраметилиндокарбоцинанин) — ненасыщенный аналог DiI с более высокой скоростью латеральной диффузии в клеточных мембранах, чем у исходного DiI. Данное свойство делает краситель особенно полезным для маркирования нейронов как в живых, так и в фиксированных тканях. RAPID DiO (дилинолеил DiO; FAST DiO™; 1,1’-дилинолеил-3,3’-оксакарбоцинанин) представляет собой ненасыщенный аналог DiO с более высокой скоростью латеральной диффузии в клеточных мембранах, чем у исходного DiO. Данное свойство делает краситель особенно полезным для маркирования нейронов как в живых, так и в фиксированных тканях.

Йодистый пропидий — непроникающий сквозь плазматическую мембрану интеркалирующий ДНК-краситель, позволяющий различать популяции некротических, апоптотических и здоровых клеток на основе целостности мембраны. После связывания с ДНК, краситель излучает в оранжево-красном канале с максимумом поглощения при 535 нм и максимумом эмиссии при 617 нм. Квантовый выход комплекса с ДНК в 20-30 раз выше свободного красителя. Йодистый Пропидий также связывается с РНК, поэтому для различения окрашивания РНК и ДНК требуется предварительная обработка препарата нуклеазами. Йодистый Пропидий также широко используется при флуоресцентном окрашивании и визуализации клеточной стенки растений. Мы предлагаем краситель в виде сухого вещества и в форме 0,1 мг/мл водного раствора. Водный раствор красителя является компонентом Набора для определения апоптотических клеток с помощью аннексина V-AF 488.

CM-DiI — оранжево-красный флуоресцентный карбоцианиновый краситель, содержащий тиол-реактивную хлорметильную (CM) функциональную группу. CM-DiI маркирует клеточные мембраны за счет встраивания двух длинных углеводородных цепей (углерод C18) в липидный бислой. Краситель слабо флуоресцирует до включения в мембраны. CM-DiI используется для мечения клеток и оценки их пролиферации in vivo и in vitro, а также для трекинга клеток и мониторинга их подвижности. Краситель переносится в дочерние клетки и не просачивается в соседние клетки популяции. Окрашивание CM-DiI показывает яркую флуоресценцию в течение не менее 72 часов (около трех-шести поколений клеток). Внутри клетки CM-DiI не проявляет цитотоксичности и минимально воздействует на пролиферативную способность или биологию клетки. В отличие от других мембранных красителей, CM-DiI обладает повышенной растворимостью в воде и может фиксироваться традиционными альдегидными фиксаторами. CM-DiI также сохраняется в клетках после их пермеабилизации. Все это позволяет сочетать мечение с помощью CM-DiI с другими гистологическими методами, такими как иммунохимия, оптическое просветление и т.д.

Neuro-DiO представляет собой зеленый флуоресцентный липофильный карбоцианиновый краситель с максимумом возбуждения при 497 нм и максимумом эмиссии при 514 нм. Neuro-DiO является аналогом DiO, широко используемого антероградного и ретроградного нейротрейсера и мембранного красителя для живых и фиксированных тканей и клеток. В отличие от DiO, Neuro-DiO обладает лучшей растворимостью в мембранах и менее склонен к образованию нефлуоресцентных агрегатов, снижающих скорость диффузии красителя. Neuro-DiO равномерно метит нейроны посредством диффузии в плазматической мембране. В интактной ткани краситель не переходит из меченых клеток в немеченые, однако, такой перенос может наблюдаться при повреждении мембран, например, после секционирования ткани. Neuro-DiO можно использовать совместно с другими липофильными трейсерами (DiI, DiD, DiR и т. д.) в задачах двухцветного и многоцветного имиджинга.

LumiTracker Mito Green FM — катионный зеленый флуоресцентный краситель, окрашивающий митохондрии в живых клетках. Краситель пассивно диффундирует через плазматическую мембрану и избирательно накапливается в активных митохондриях в зависимости от мембранного потенциала в них, поэтому часто используется для оценки состояния клеток, а также как краситель для локализации митохондрий. Флуоресценция LumiTracker Mito Green FM исчезает после фиксации альдегидами, поэтому данный краситель подходит только для работы с живыми клетками.

YODi-3 (гомодимер Оксазолового Красного, также известный как YOYO®-3) — димерный краситель на основе карбоцианина с флуоресценцией в красной области спектра. YODi-3 — непроникающий в живые клетки ядерный краситель, который не флуоресцирует в отсутствие нуклеиновых кислот. Краситель значительно усиливает свою флуоресценцию при связывании с ДНК. YODi-3 идеален для окрашивания нуклеиновых кислот на микрочипах, а также для контрастного окрашивания ядер и хромосом в экспериментах с многоцветным флуоресцентным мечением благодаря яркому сигналу и низкой фоновой флуоресценции. Одновременное мечение с помощью YODi-3 (непроникающим в клетки) и LUCS 13 (проникающим в клетки прижизненным ядерным маркером) или аннексином V-AF488 можно использовать для оценки жизнеспособности клеток и апоптоза.

Тиазоловый Оранжевый представляет собой асимметричный цианиновый краситель, флуоресценция которого сильно зависит от его ближнего окружения. Тиазоловый Оранжевый практически не светится в растворе, однако тысячекратно усиливает свою флуоресценцию при его введении в двухцепочечные ДНК и РНК. Максимум поглощения Тиазолового Оранжевого в комплексе с ДНК — 509 нм, максимум излучения — 532 нм. Раствор Тиазолового Оранжевого широко используется для определения процентного содержания ретикулоцитов в периферической крови человека с помощью микроскопии и проточной цитометрии. Мы также предлагаем готовый к использованию раствор Тиазолового Оранжевого LumiCell Reticulocyte Stain для этих целей.

Аннексин V (или Аннексин A5) принадлежит семейству аннексинов, внутриклеточных белков, связывающих фосфолипиды. Аннексин V обычно используется в проточной цитометрии и флуоресцентной микроскопии для определения апоптотических клеток, благодаря его способности специфически связываться с фосфатидилсерином (ФС) кальций-зависимым образом. Метод был впервые описан Koopman с соавт. (1994) [1]. В здоровых клетках ФС содержится только с внутренней стороны плазматической мембраны. Во время апоптоза мембранная асимметрия исчезает, ФС перемещается на наружную сторону мембраны и становится доступным для связывания флуоресцентно меченным Аннексином V. В сочетании с другими прижизненными красителями, такими как йодистый пропидий (PI), метод позволяет различать популяции здоровых (Annexin−PI−), апоптотических (Annexin+PI−) и некротических (Annexin+PI+) клеток [2]. Готовый набор содержит все необходимые реагенты для мечения апоптотических клеток с помощью Аннексина V, конъюгированного с AF 488, и PI. AF 488 — сульфированный родамин, яркий, фотостабильный и гидрофильный флуорофор. Краситель излучает в зеленом канале. Спектральные характеристики красителя сходны с FITC. Максимум поглощения — 495 нм. Максимум эмиссии — 519 нм. PI — непроницаемый сквозь плазматическую мембрану ДНК-краситель, позволяющий различать популяции некротических, апоптотических и здоровых клеток на основе целостности мембраны. После связывания с ДНК краситель излучает в оранжево-красном канале. Максимум поглощения — 535 нм. Максимум эмиссии — 617 нм.

Аннексин V (или Аннексин A5) принадлежит семейству аннексинов, внутриклеточных белков, связывающих фосфолипиды. Аннексин V обычно используется в проточной цитометрии и флуоресцентной микроскопии для определения апоптотических клеток, благодаря его способности специфически связываться с фосфатидилсерином (ФС) кальций-зависимым образом. Метод был впервые описан Koopman с соавт. (1994) [1]. В здоровых клетках ФС содержится только с внутренней стороны плазматической мембраны. Во время апоптоза мембранная асимметрия исчезает, ФС перемещается на наружную сторону мембраны и становится доступным для связывания флуоресцентно меченным Аннексином V. В сочетании с другими прижизненными красителями, такими как йодистый пропидий (PI), метод позволяет различать популяции здоровых (Annexin−PI−), апоптотических (Annexin+PI−) и некротических (Annexin+PI+) клеток [2].Готовый набор содержит все необходимые реагенты для мечения апоптотических клеток с помощью Аннексина V, конъюгированного с AF 647, и PI. AF 647 — яркий флуоресцентный краситель, излучающий в дальнем красном канале, с высоким квантовым выходом флуоресценции и высокой фотостабильностью. Спектр AF 647 сильно отстоит от зелено-желтых длин волн, что делает этот флуорофор незаменимым для мечения клеток, обладающих высокой автофлуоресценцией. Максимум поглощения красителя — 655 нм. Максимум эмиссии — 680 нм. PI — непроницаемый сквозь плазматическую мембрану ДНК-краситель, позволяющий различать популяции некротических, апоптотических и здоровых клеток на основе целостности мембраны. После связывания с ДНК краситель излучает в оранжево-красном канале. Максимум поглощения — 535 нм. Максимум эмиссии — 617 нм.

LumiTracker Orange CM-H2TMRos — катионный оранжевый флуоресцентный краситель для окрашивания активных митохондрий в живых клетках. CM-H2TMRos пассивно диффундирует через плазматическую мембрану и избирательно накапливается в активных митохондриях в зависимости от их мембранного потенциала. CM-H2TMRos является восстановленной нефлуоресцентной версией красителя CMTMRos, который становится флуоресцентным при окислении на митохондриальной мембране. LumiTracker Orange CM-H2TMRos можно использовать для оценки состояния клеток, а также как краситель для локализации митохондрий. Флуоресценция CMTMRos хорошо сохраняется в митохондриях после фиксации альдегидами и пермеабилизации детергентами и совместима с последующими процедурами иммуноцитохимии или гибридизации in situ.

G-квадруплексы (G4s) представляют собой вторичные структуры, образующиеся в ДНК и РНК за счет неканонических водородных связей между четырьмя гуаниновыми основаниями [1,2]. В ядре ДНК G4s связаны с эпигенетической регуляцией экспрессии генов посредством их взаимодействия с регуляторными белками, такими как транскрипционные факторы и модификаторы хроматина [3,4]. РНК G4s связаны со сплайсингом, транспортом и регуляцией трансляции РНК, а также с РНК-опосредованными стрессовыми реакциями в цитоплазме клетки [5-7]. TOR-G4 — производное тиазолового оранжевого, недавно синтезированный флуоресцентный индикатор G4s [8]. TOR-G4 является низкомолекулярной альтернативой иммунохимии со специфичными к G4 антителами. TOR-G4 позволяет визуализировать G4s на основе изменений продолжительности флуоресценции индикатора при связывании им нуклеиновой кислоты. Продолжительность флуоресценции TOR-G4 самая высокая в присутствии G4s и значительно ниже с другими последовательностями. Внутри клеток TOR-G4 преимущественно колокализуется с РНК в цитоплазме и ядрышках, что делает его первым прижизненным зондом, валидированным для изучения роли РНК G4s в функционировании клеток. TOR-G4 подходит для визуализации РНК G4s с помощью FLIM [8].

DiR — карбоцианиновый краситель, флуоресцирующий в ближней инфракрасной части спектра, для мечения клеточных мембран in vivo и in vitro. DiR диффундирует латерально в плазматической мембране, постепенно окрашивая всю клетку, что позволяет использовать его в качестве антероградного и ретроградного трейсера нейронов. В интактной ткани краситель не переходит из меченых клеток в немеченые, однако такой перенос может происходить при разрушении мембран клеток, например, после секционирования образца. Краситель слабо флуоресцирует до включения в мембраны и в водной среде. DiR может быть использован совместно с другими трейсерами в многоцветных окрашиваниях, например, с DiI и DiO и для NIR-имиджинга.

DiI (DiIC18(3); 1,1’-диоктадецил-3,3,3’,3’-тетраметилиндокарбоцианин) — карбоцианиновый краситель, флуоресцирующий в оранжево-красной части спектра. DiI — широко используемый липофильный краситель, который маркирует клеточные мембраны за счет встраивания двух длинных углеводородных цепей (углерод C18) в липидный бислой. Краситель слабо флуоресцирует до включения в мембраны. DiI диффундирует латерально в плазматической мембране, постепенно окрашивая всю клетку, что позволяет использовать его в качестве антероградного и ретроградного трейсера нейронов. В интактной ткани краситель не переходит из меченых клеток в немеченые, однако такой перенос может происходить при разрушении мембран клеток, например, после секционирования образца. DiI часто используется совместно с другими трейсерами в двухцветных окрашиваниях, например, с DiA и DiO.