ДНКаза Е, 100 е.а.

ДНКаза Е — термостойкая эндонуклеаза, разрушающая ДНК до одноцепочечных олигонуклеотидов. Ферментативная активность проявляется в присутствии катионов кальция и магния, а ее оптимум достигается при слабокислом рН и повышенной температуре.

Протеиназа К — сериновая протеаза, обладающая широким спектром специфичности. Фермент гидролизует пептидные связи со стороны карбоксильной группы ароматических, алифатических и гидрофобных аминокислот. Используется для очистки ферментативных смесей и клеточных лизатов от белковых примесей различной природы, для инактивации нуклеаз, а также для повышения эффективности лизиса тканей при выделении нуклеиновых кислот.

Протеиназа К — сериновая протеаза, обладающая широким спектром специфичности. Фермент гидролизует пептидные связи со стороны карбоксильной группы ароматических, алифатических и гидрофобных аминокислот. Используется для очистки ферментативных смесей и клеточных лизатов от белковых примесей различной природы, для инактивации нуклеаз, а также для повышения эффективности лизиса тканей при выделении нуклеиновых кислот

Дуплекс-специфическая нуклеаза (ДСН) очищена из гепатопанкреаса камчатского краба с помощью модифицированного протокола. ДСН – термостабильная нуклеаза, обладающая специфичностью к двухцепочечной (дц) ДНК. ДСН проявляет гидролитическую активность в присутствии ионов двухвалентных металлов (например, Mg2+). ДСН может быть использована для удаления двухцепочечной ДНК из сложных смесей нуклеиновых кислот, например при нормализации образцов кДНК или при определении длины выступающих теломерных концов.

Дуплекс-специфическая нуклеаза (ДСН) очищена из гепатопанкреаса камчатского краба с помощью модифицированного протокола. ДСН – термостабильная нуклеаза, обладающая специфичностью к двухцепочечной (дц) ДНК. ДСН проявляет гидролитическую активность в присутствии ионов двухвалентных металлов (например, Mg2+). ДСН может быть использована для удаления двухцепочечной ДНК из сложных смесей нуклеиновых кислот, например при нормализации образцов кДНК или при определении длины выступающих теломерных концов.

Протеиназа К — сериновая протеаза, обладающая широким спектром специфичности. Фермент гидролизует пептидные связи со стороны карбоксильной группы ароматических, алифатических и гидрофобных аминокислот. Используется для очистки ферментативных смесей и клеточных лизатов от белковых примесей различной природы, для инактивации нуклеаз, а также для повышения эффективности лизиса тканей при выделении нуклеиновых кислот.

Дуплекс-специфическая нуклеаза (ДСН) очищена из гепатопанкреаса камчатского краба с помощью модифицированного протокола. ДСН – термостабильная нуклеаза, обладающая специфичностью к двухцепочечной (дц) ДНК. ДСН проявляет гидролитическую активность в присутствии ионов двухвалентных металлов (например, Mg2+). ДСН может быть использована для удаления двухцепочечной ДНК из сложных смесей нуклеиновых кислот, например при нормализации образцов кДНК или при определении длины выступающих теломерных концов.

«ALZYME RT» – вы­со­ко­очи­щен­ный ре­ком­би­нант­ный фер­мент, пред­наз­на­чен­ный для про­ве­де­ния об­рат­ной транс­крип­ции. Фер­мент яв­ляет­ся аль­тер­на­ти­вой MMLV ре­вер­та­зы с ря­дом преи­муществ: об­ла­дает по­вы­шен­ной тер­мо­ста­биль­ностью и про­цес­сив­ностью. Поз­во­ляет син­те­зи­ро­вать фраг­менты кДНК дли­ной до 12 000 п.н. Оп­ти­маль­ная тем­пе­ра­ту­ра ра­бо­ты – 50 ℃. Ус­ло­вия для инак­ти­ва­ции: 80 ℃ (10 ми­нут). Время ин­ку­ба­ции (син­те­за) за­ви­сит от мат­ри­цы и варьи­рует в пре­де­лах от 10 се­кунд до 60 ми­нут. По свойст­вам об­рат­ная транс­крип­та­за «ALZYME RT» схо­жа с FeLV, ко­то­рая по своей при­ро­де точ­нее, чем MMLV-RT. Об­рат­ная транс­крип­та­за «ALZYME RT» со­дер­жит му­та­ции, ко­то­рые до­пол­ни­тель­но по­вы­шают тер­мо­ста­биль­ность и точ­ность. Буфер реак­цион­ный «ALZYME RT B» обес­пе­чи­вает оп­ти­маль­ные ус­ло­вия для ра­бо­ты обрат­ной транс­крип­та­зы «ALZYME RT». Обрат­ная транс­крип­та­за «ALZYME RT» под­хо­дит для про­ве­де­ния ОТ-ПЦР «в одной про­бир­ке» с ис­поль­зо­ва­нием «ALZYME Taq».

Genta-RT kit представляет собой набор реагентов для проведения синтеза первой цепи кДНК на матрице РНК. Набор включает в себя: in silico модифицированный гомолог обратной транскриптазы вируса лейкемии мышей Молони (MMLV) – Genta REV M ревертазу; Олиго(dT)18 праймер; воду для ПЦР и 2 вида 5-кратного реакционного буфера (включающего в себя дНТФ и ДТТ): 5х ОТ-буфер R – наличие Random-праймеров в реакционном буфере позволяет проводить синтез тотальной кДНК. 5х ОТ-буфер – требуется добавление специфических праймеров для синтеза целевого фрагмента кДНК; или добавление Олиго(dT)18 праймера для полиаденилированной РНК.

 Преимущества набора: • ДНК из любых реакционных смесей, фрагменты длины от 70 до 20000 п. о. • Показатели А260/280 = 1,80±0,05, А260/230 ≥ 2,0 • Выделенный ПЦР-продукт пригоден для проведения лигирования, рестрикции, трансформации, секвенирования, ПЦР.

Источник: Выделена из штамма E.coli, несущего рекомбинантную плазмиду. Описание: TaqSE ДНК полимераза является сложной смесью термостабильных ДНК-полимераз. Катализирует матричный синтез ДНК путем переноса нуклеотида от dNTP на 3` конец ДНК. Препарат TaqSE ДНК полимеразы обеспечивает более высокую точность копирования ДНК, уменьшает количество побочных продуктов. Может образовывать продукты с тупыми концами благодаря наличию 3`->5` экзонуклеазной активности. Выход продукта может быть выше по сравнению с Taq ДНК полимеразой. Определение единицы активности: За одну единицу активности TaqSE ДНК полимеразы принимали количество фермента,необходимое для включения 10 нмолей dNTP в кислотонерастворимую фракцию за 30 мин при 72°С. Оптимальный буфер: SE-буфер ДНК полимераза Taq Условия хранения: 20 mM Tris-HCl (pH 7.6); 100 mM KCl; 0.1 mM EDTA; 1 mM DTT; 0,5 % Тритон Х-100; 50% глицерин. Хранить при -20°С Примечание: Не для рутинного использования, для специального применения! Протокол для проведения ПЦР с TaqSE ДНК полимеразой отличается от протокола проведения ПЦР с Taq ДНК полимеразой. TaqSE ДНК полимераза при использовании ферментативно синтезированных трифосфатов (Смесь dNTP(ферм.) для ПЦР 2.5mM каждого, кат.номер N026) тестирована в ПЦР при амплификации фрагмента ДНК фага Т7 длиной 15 тыс. пар нуклеотидов.

Источник: Выделена из штамма E.coli несущего клонированный ген Неорганической пирофосфатазы из Thermococcus litoralis. Описание: Катализирует гидролиз неорганического пирофосфата с образованием ортофосфата.Фермент чрезвычайно термостабилен. Определение единицы активности: За одну единицу активности принимали количество фермента, необходимое для образования 40 нмолей фосфата за 1 мин из пирофосфата в стандартных условиях реакции (50 мМ Tris-HCl (pH 8.5); 1 mM MgCl2; 0.32 mM Ppi) при 75°С. Оптимальный буфер: SE-буфер Неорганическая пирофосфатаза Условия хранения: 20 mM Tris-HCl (pH 7.6); 0.1 mM EDTA; 100 mM KCl, 0.2% Tween-20; 50% глицерин. Хранить при -20°С.

Термолабильная щелочная фосфатаза удаляет фосфаты с 5`- и 3`-концов ДНК, РНК и ДНТФ. Может быть использована вместо антарктической фосфатазы Источник: Выделена из штамма E.coli несущего клонированный ген щелочной фосфатазы из Alteromonas undina P2 Описание: Термолабильная щелочная фосфатаза (англ. TAP) катализирует дефосфорилирование 5`- и 3`-концов ДНК и РНК. Также гидролизует рибо- и дезоксирибонуклеозидтрифосфаты. Определение единицы активности: За единицу активности принимали количество фермента, необходимое для гидролиза 1 μмоля пара-нитрофенилфосфат (PNPP) в 0,5 мл реакционной смеси за 15 мин при 16°C. Реакционная смесь содержала 1Х SE-буфер W, 10 mM пара-нитрофенилфосфат. Оптимальный буфер: SE-буфер W Условия хранения: 20 mM Tris-HCl (pH 7.6 при 25°:C); 0.1 mM ZnCl2; 50% глицерин. Хранить при -20°С. Примечание: Термолабильную щелочную фосфатазу не рекомендуется разбавлять ввиду возможной потери активности. Функциональный тест: В результате обработки 1 мкг ДНК плазмиды pUC19/HindIII в 20 мкл реакционной смеси, содержащей 1Х SE -буфер W и 1 мкл препарата фермента, в течение 30 мин при 16°C и последующей сшивки с помощью Т4 ДНК лигазы и трансформации клеток E.coli,получали >10-кратное уменьшение числа выросших колоний по сравнению с использованием необработанной ДНК pUC19/Hind III. Протокол дефосфорилирования 5′-концов ДНК с помощью ТАР после гидролиза эндонуклеазой рестрикции (ЭР): На 20 мкл реакционной смеси: 10Х SE буфер ЭР (или буфер “W”) – 2 мкл, ДНК – 0,5-1мкг, деионизованная вода – до 20 мкл. Добавить 1 мкл эндонуклеазы рестрикции, перемешать пипетированием. Инкубировать в течении 0,5-1 часа при оптимальной температуре. Охладить реакционную смесь во льду в течение 1-2 мин!!! Добавить 1 мкл (5 ед.) щелочной фосфатазы (Е365/Е366), перемешать пипетированием. Инкубировать в течение 0,5-1 часа при 16°C(при 25°C активность фермента составляет 75-100%). Прогреть реакционную смесь при 65°C в течение 20 мин. Можно использовать обработанную ДНК для дальнейших экспериментов. Если требуется, очистить ДНК гель-фильтрацией, на спин-колонках или высадить 96%-ным этанолом.

Источник: Выделена из штамма E.coli, содержащего клонированный ген полинуклеитидкиназы из бактериофага Т4 Описание: Катализирует перенос (и обмен) концевой фосфатной группы АТФ на 5`-гидроксильную группу ДНК (РНК). Определение единицы активности: За одну единицу активности Т4 полинуклеотидкиназы принимали количество фермента, необходимое для включения 1 нмоля [32P] в кислотонерастворимую фракцию за 30 мин при 37°С. Оптимальный буфер: SE-буфер полинуклеотидкиназа T4 Условия хранения: 10 mM Tris-HCl (pH 7.5); 50 mM NaCl;0.1 mM EDTA; 1 mM DTT; 50% глицерин. Хранить при -20°С.

Источник: Выделена из штамма E.coli, несущего клонированный ген I фага T7. Описание: Катализирует синтез РНК, используя в качестве матрицы ДНК, содержащую промотор фага Т7. T7 РНК полимераза используется для приготовления меченого РНК зонда и для проведения транскрипции in vitro. Определение единицы активности: За одну единицу активности T7 РНК полимеразы принимали количество фермента необходимое для включения 1 нмоля NTP в кислотонерастворимую фракцию за 60 мин при 37°С. Оптимальный буфер: SE-буфер Т7 РНК полимераза Условия хранения: 50 mM Tris-HCl (pH 7.5); 100 mM NaCl; 1 mM EDTA; 20 mM 2-меркаптоэтанол; 0,1% Тритон Х-100; 50% глицерин. Хранить при -20°C.

Источник: Из штамма E.coli, несущего рекомбинантный ген Описание: Экзонуклеаза III E.coli катализирует ступенчатое удаление мононуклеотидов с 3’-гидроксильного конца каждой из цепей двуцепочечной ДНК (работает в направлении 3’—>5’), если у этой ДНК «тупые» или 5’-выступающие концы. Экзонуклеаза III способна использовать в качестве субстрата и ДНК с 3’-выступающими концами, но только в случае, если длина такого выступающего конца менее 4-х нуклеотидов. Фермент также обладает эндонуклеазной активностью по отношению к апуринизированной ДНК, гидролизует РНК в РНК-ДНК-гибридах и обладает 3′-фосфатазной активностью. Определение единицы активности: За одну единицу активности принимали количество фермента, необходимого для образования 1 нмоля кислоторастворимых продуктов гидролиза за 30 мин при 37°С. Оптимальный буфер: SE-буфер Экзонуклеаза III Условия хранения: 10 mM Tris-HCl (pH 7.5); 50 mM KCl; 0.5 mM EDTA; 1 mM 2-меркаптоэтанол; 50% глицерин. Хранить при -20°С.